第一篇 临床血液学检验
第一章 临床血液一般检验
第一节 血液标本的采集与处理
（一）普通采血法
1.试剂与器材
（1）30g/L碘酊。
（2）75%酒精（乙醇）。
（3）其他：一次性注射器、压脉带、垫枕、试管、消毒棉签。
2.操作
（1）取试管1支（需抗凝者应加相应抗凝剂）。
（2）打开一次性注射器包装，取下针头无菌帽，将针头与针筒连接，针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气，排尽注射器内的空气，套上针头无菌帽，备用。
（3）受检者取坐位，前臂水平伸直置于桌面枕垫上，选择容易固定、明显可见的肘前静脉或手背静脉，幼儿可从颈外静脉采血。
（4）用30g/L碘酊自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%酒精以同样方式脱碘，待干。
（5）在穿刺点上方约6cm处系紧压脉带，嘱受检者紧握拳头，使静脉充盈显露。
（6）取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，示指固定针头下座，针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角，快速刺入皮肤，然后成5°角向前刺破静脉壁进入静脉腔。见回血后，将针头顺势深入少许。穿刺成功后右手固定注射器，左手松压脉带后，再缓缓抽动注射器针栓至所需血量。受检者松拳，消毒干棉球压住穿刺孔，拔出针头。嘱受检者继续按压针孔数分钟。
（7）取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入试管中。抗凝血需立即轻轻混匀，盖紧试管塞，及时送检。
3.注意事项
（1）采血部位通常选择肘前静脉，如此处静脉不明显，可采用手背、手腕、窝和外踝部静脉。幼儿可采用颈外静脉。
（2）采血一般取坐位或卧位，体位影响水分在血管内外的分布，从而影响被测血液成分浓度。
（3）压脉带捆扎时间不应超过1分钟，否则会使血液成分浓度发生改变。
（4）血液注入试管前应先取下注射器针头，然后将血液沿试管壁缓缓注入试管中，防止溶血和泡沫产生。需要抗凝时应与抗凝剂轻轻颠倒混匀，切忌用力振荡试管。
（5）如遇受检者发生晕针，应立即拔出针头，让其平卧。必要时可用拇指压掐或针刺人中、合谷等穴位，或嗅吸芳香酊等药物。
（二）真空采血管采血法
1.原理 将有头盖胶塞的采血试管预先抽成不同的真空度，利用其负压自动定量采集静脉血样。
2.试剂与器材 目前真空采血器有软接式双向采血针系统（头皮静脉双向采血式）和硬接式双向采血针系统（套筒双向采血式）两种，都是一端为穿刺针，另一端为刺塞针。另附不同用途的一次性真空采血管，有的加有抗凝剂或其他添加剂，均用不同颜色头盖标记，便于识别。真空采血法符合生物安全要求。
3.操作
（1）消毒：为受检者选静脉与消毒。
（2）采血：方法如下。①软接式双向采血针系统采血：拔除采血穿刺针的护套，以左手固定受检者前臂，右手拇指和示指持穿刺针，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角，快速刺入皮肤，然后成5°角向前刺破静脉壁进入静脉腔，见回血后将刺塞针端（用橡胶管套上的）直接刺穿真空采血管盖中央的胶塞中，血液自动流入试管内。如需多管血样，将刺塞端拔出，刺入另一真空采血管即可。达到采血量后，松压脉带，嘱受检者松拳，拔下刺塞端的采血试管。将消毒干棉球压住穿刺孔，立即拔除穿刺针，嘱受检者继续按压针孔数分钟。②硬连接式双向采血针系统采血：静脉穿刺如上，采血时将真空采血试管拧入硬连接式双向采血针的刺塞针端中，静脉血就会自动流入采血试管中。拔下采血试管后，再拔出穿刺针头。
（3）抗凝血：需立即轻轻颠倒混匀。
4.注意事项
（1）使用真空采血器前应仔细阅读厂家说明书，严格按说明书要求操作。
（2）尽量选粗大的静脉进行穿刺。
（3）刺塞针端的乳胶套能防止拔除采血试管后继续出血污染周围，达到封闭采血防止污染环境的作用，因此不可取下乳胶套。
（4）带乳胶套的刺塞端须从真空采血试管的胶塞中心垂直穿刺。
（5）采血完毕后，先拔下刺塞端的采血试管，后拔穿刺针端。
（6）使用前勿松动一次性真空采血试管盖塞，以防采血量不准。
（7）如果一次采血要求采取几个标本时，应按以下顺序采血：血培养管→无抗凝剂及添加剂管→凝血象管→有抗凝剂（添加剂）管。
1.试剂与器材
（1）一次性采血针。
（2）消毒干棉球。
（3）75%酒精棉球。
（4）经过校正的20μL吸管。
2.操作
（1）采血部位：成人以左手环指为宜，1岁以下婴幼儿通常用拇指或足跟两侧采血。
（2）轻轻按摩采血部位，使其自然充血，用75%酒精棉球消毒局部皮肤，待干。
（3）操作者用左手拇指和示指紧捏刺血部位两侧；右手持无菌采血针，自指尖内侧迅速穿刺。
（4）用消毒干棉球擦去第一滴血，按需要依次采血。
（5）采血完毕，用消毒干棉球压住伤口止血。
3.注意事项
（1）除特殊情况外，不要在耳垂采血。应避免在冻疮、炎症、水肿等部位采血。
（2）皮肤消毒后一定要待乙醇挥发，干燥后采血，否则血液会四处扩散而不成滴。
（3）穿刺深度一般以2.0～2.5mm为宜，稍加挤压血液就能流出。
（4）进行多项检验时，采集标本次序为：血小板计数→红细胞计数→血红蛋白测定→白细胞计数及涂血片等。
临床血液学检验中常用的抗凝剂有以下3种。
1.枸橼酸钠（柠檬酸钠）枸橼酸能与血液中的钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。市售枸橼酸钠多含2分子结晶水，相对分子质量为294.12，常用浓度为109mmol/L（32g/L）。枸橼酸钠与血液的比例多采用1:9（V:V），常用于凝血象和红细胞沉降率测定（魏氏法红细胞沉降率测定时抗凝剂为1:4，即抗凝剂0.4mL加血1.6mL）。
2.乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝机制与枸橼酸钠相同。全血细胞分析用EDTA-K2（1.5～2.2）mg可阻止1mL血液凝固。适用于全血细胞分析，尤其适用于血小板计数。但由于其影响血小板聚集及凝血因子检测，故不适合做凝血象和血小板功能检查。
3.肝素 是一种含有硫酸基团的黏多糖，相对分子质量为15000，与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，促进其对凝血因子Ⅺ、Ⅻ、Ⅸ、Ⅹ和凝血酶活性的抑制，抑制血小板聚集从而达到抗凝作用。通常用肝素钠盐或锂盐粉剂（125U=1mg）配成1g/L肝素水溶液，即每毫升含肝素1mg。取0.5mL置小瓶中，37～50℃烘干后，能抗凝5mL血液。适用于红细胞比容测定，因其可使白细胞聚集，并使血涂片染色后产生蓝色背景，故不适合做凝血象和血液学一般检查。
1.器材 清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片（25mm×75mm，厚度为0.8～12mm）。
2.操作 血涂片制备方法很多，目前临床实验室普遍采用的是手工推片法，在玻片近一端1/3处，加一滴（约0.05mL）充分混匀的血液，握住另一张边缘光滑的推片，以30°～45°角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端。
3.注意事项
（1）血涂片通常呈舌状或楔形，分头、体、尾三部分。
（2）推好的血涂片应在空气中晃动，使其尽快干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃恒温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。
（3）涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。红细胞比容高于正常时，血液黏度较高，保持较小的角度，可获得满意结果；相反，红细胞比容低于正常时，血液较稀，则应用较大角度、推片速度应较快。
（4）血涂片应在1小时内染色或在1小时内用无水甲醇（含水量＜3%）固定后染色。
（5）新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用浓度约1mol/L的HCl浸泡24小时后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20分钟，洗净，再用清水反复冲洗，最后用蒸馏水浸洗，擦干备用。使用时，切勿用手触及玻片表面。
（6）血液涂片既可直接用非抗凝的静脉血或毛细血管血，也可用EDTA-K2抗凝血制备。由于EDTA-K2能阻止血小板聚集，故在显微镜下观察血小板形态时非常合适。
（7）使用EDTA-K2抗凝血液样本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血样本应在采集后4小时内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态改变。注意制片前，样本不宜冷藏。
（一）瑞氏染色法
1.原理 瑞氏（Wright）染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲和力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。
2.试剂
（1）瑞氏染液。
瑞氏染料 0.1g
甲醇（AR） 60.0mL
瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝的氧化物（天青）组成。将瑞氏染料放入清洁干燥的研钵里，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。染料配好后放于室温下，1周后即可使用。新配染液效果较差，放置时间越长，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油2～3mL，除可防止甲醇过早挥发外，还可使细胞着色清晰。
（2）pH6.8磷酸盐缓冲液。
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.3g
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 0.2g
加少量蒸馏水溶解，再加至1000mL。
3.操作
（1）采血后推制厚薄适宜的血涂片（见血涂片制备相关内容）。
（2）用蜡笔在血膜两头画线，然后将血涂片平放在染色架上。
（3）加瑞氏染液数滴，以覆盖整个血膜为宜，固定血膜约1分钟。
（4）滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色5～10分钟。
（5）用流水冲去染液，待干燥后镜检。
4.注意事项
（1）pH对细胞染色有影响：由于细胞中各种蛋白质均为两性电解质，所带电荷由溶液pH决定。对某一蛋白质而言，如环境pH＜pI（蛋白质的等电点），则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与美蓝天青结合，染色偏蓝。为此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用pH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。
（2）未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜易脱落。
（3）染色时间与染液浓度、染色时的温度成反比；与细胞数量成正比。
（4）冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。
（5）如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。
（6）染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。
（7）染色过深可用水冲洗血涂片或将其浸泡在水中一定时间，也可用甲醇脱色。
（8）染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。
（9）瑞氏染液的质量好坏除用血涂片实际染色效果评价外，还可采用吸光度比值（RA）评价。瑞氏染液的成熟指数以RA（A650nm/A525nm）=1.3±0.1为宜。
（10）目前已有商品化瑞氏染液及缓冲液供应。
（二）瑞氏—姬姆萨复合染色法
姬姆萨染色原理与瑞氏染色相同，但提高了噻嗪染料的质量，加强了天青的作用，对细胞核着色效果较好，但对中性颗粒着色较瑞氏染色差。因此，瑞氏—姬姆萨（Wright-Giemsa）复合染色法可取长补短，使血细胞的颗粒及细胞核均能获得满意的染色效果。
1.试剂 瑞氏—姬姆萨复合染色液。
Ⅰ液：取瑞氏染料1g、姬姆萨染料0.3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯），研磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇继续研磨，再吸出上层染液。如此连续几次，共用甲醇500mL。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3分钟，共5天，以后存放1周即能使用。
Ⅱ液：pH6.4～6.8磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾（无水） 6.64g
磷酸氢二钠（无水） 2.56g
加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000mL。
2.操作 瑞氏—姬姆萨染色法与瑞氏染色法相同。