第一节 调控骨形成相关信号通路
骨形成代谢主要分为膜内成骨和软骨内成骨。研究证实，成骨细胞（osteoblast， OB）在膜内成骨过程中起重要的作用，而软骨细胞在软骨内成骨过程中扮演着重要的角色。目前，有关骨形成代谢的研究主要集中在膜内成骨以及成骨细胞的分化、成熟上，软骨细胞调控软骨内成骨的相关研究较少。成骨细胞由骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell， BMSC）分化产生。Stein等将成骨细胞分化和生长的过程主要分为增殖、细胞外基质成熟、矿化和凋亡4个阶段。在各个阶段中的成骨细胞均存在特异性基因的表达，而这些特异性基因的表达对于成骨细胞的分化、生长及骨形成功能的发挥均具有重要的调控作用。调控成骨细胞分化和成熟的各个阶段的特异性基因表达也受到多种信号转导途径的调控，如转录生长因子β（transforming growth factor beta， TGF-β）/骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）、Wnt/β-catenin、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）/反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein， CREB）/转录激活因子4（activating transcription factor 4， ATF4）、Hedgehog信号通路（HH）及Notch信号通路等。这些信号通路在成骨细胞的分化、成熟及成骨过程中均起着重要的作用。
一、TGF-β/BMP信号通路
骨组织抵抗骨折发生的能力与骨量、骨结构、骨力学特性和骨基质的组成成分等都有密切的关系。然而皮质骨厚度、松质骨量和松质骨的形态结构在骨组织形态结构中也具有重要的作用。骨组织中许多信号通路如TGF-β/Smads等，在调控骨量、骨组织形态结构以及骨组织疾病发生（如骨质疏松）中均具有重要的调控作用。目前，有关骨组织的力学特性是否与骨基质中由成骨细胞和骨细胞合成分泌的特殊蛋白和矿物质丰富的细胞外物质相关的研究较少，尚有很多不清楚之处尚待探究。然而，骨基质质量对于临床上的骨代谢紊乱，如成骨不全症、骨质疏松等都具有重要的意义。研究发现，激活TGF-β/Smads信号通路在调控骨形成代谢以及提高骨基质质量上均起着重要的作用。Kang等研究发现，Smad3被TGF-β激活后可上调其下游靶基因成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor 2， Runx2）、骨钙素（osteocalcin， OCN）等的表达，从而促进成骨细胞的分化及骨基质形成。另有研究证实，TGF-β/Smads信号通路还可调控骨桥蛋白（osteopontin， OPN）、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶类等的表达。这些蛋白不仅在骨基质沉积和矿化中起着重要的作用，并且TGF-β也可调控这些蛋白的表达进而影响骨基质的特性。
由TGF-β主导的自分泌和旁分泌对成骨细胞前体细胞——干细胞，或者前体细胞的保持和增殖具有重要的作用。在骨和软骨内有TGF-β的大量表达，并且亦存在大量的TGF-β靶细胞。TGF-β可选择性地与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和Smad2/3信号通路，或者与甲状旁腺激素（parathyroid hormone， PTH）、Wnt、BMP和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）信号通路相互作用促进成骨细胞前体细胞增殖、早期分化并作用于成骨细胞。TGF-β信号通路主要分为经典和非经典两条通路。
TGF-β亚型及其受体-Ⅰ型受体（TGF-βRI或ALK5）和Ⅱ型受体（TGF-βRⅡ或Tgfbr2）在软骨内成骨和膜内成骨过程中起着重要的作用。当敲除TGF-β1后，骨生长和矿化受到显著抑制。而同时敲除TGF-β2和TGF-β3后的小鼠呈现肋骨远端缺失。而当对TGF-βR、TGFBR2进行条件敲除后，发现胫骨、颅骨、脊椎骨及软骨等出现发育障碍。说明TGFBR2在膜内成骨和软骨内成骨过程中都起着重要的作用。
TGF-β是一种具有多种功能的多肽生长因子，其与组织再生、胚胎发育、成骨细胞分化和骨组织代谢等多个生物学过程密切相关。在TGF-β信号通路中的R-Smad主要是Smad2和Smad3。TGF-β通过与膜上受体丝氨酸/苏氨酸激酶受体——TGF-βRⅡ结合并将其激活，活化后的TGF-βRⅡ激活膜内受体TGF-βRⅠ，磷酸化胞质内的细胞信号分子Smad2和Smad3。Smad2/3磷酸化后可与Smad4结合，形成信号转导复合体进入核内调控相关靶蛋白的表达。而激活Smad7是另一条调控R-Smad功能的信号通路。其可以靶向地调控TGF-β受体降解。Smad7发生突变后，可抑制Smad泛素化调节因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，Smurf2）与其受体的结合及其活性。Smad7是TGF-β信号通路的调节因子之一，其可与Smad4竞争性地与Smad2/3形成复合体从而在骨形成代谢、骨吸收代谢以及出生后的骨代谢平衡中发挥重要作用。研究发现，TGF-β/Smad信号通路的靶基因主要包括Runx2、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、碱性亮氨酸拉链（basic region/leucine zipper motif，bZIP）、叉头框（forkhead-box，Fox）、碱性螺旋-环-螺旋蛋白（basic helix-loop-helix protein，bHLH）及Sp1等。其中细胞内的Smad蛋白家族主要分为3类：① 受体激活型Smads（R-Smads）、② 通用配体型Smads（Co-Smads）和③ 抑制型Smads（I-Smads）。近来，有研究发现，Smad2/3还可与肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptors 6，TRAF6）-TGF-β激酶1（TGF-β kinase 1，TAK1）结合蛋白1（TAK1 binding protein 1，TAB1）-TAK1分子复合体直接相互作用。当抑制TGF-β信号通路后，未能观察到TRAF6-TAB1-TAK1分子复合体，提示TGF-β1在核因子-κb受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL）诱导破骨细胞（osteoclast，OC）分化过程中是必不可少的。当TGF-β1抑制成骨细胞分泌的RANKL（促进破骨细胞分化的重要细胞因子）的活性时，其可促进骨基质形成和成骨细胞分化。因此，TGF-β1通过间接地抑制破骨细胞形成来影响骨量。目前研究证实，TGF-β/Smads信号通路在调控骨形成代谢和骨吸收代谢中具有重要的调控作用。
非经典的不依赖于Smads的TGF-β信号通路在成骨细胞分化和骨形成过程中也扮演着重要的角色。在对三苯氧胺诱导的Cre-ER调控的ALK5缺失颅骨细胞进行培养时，TGF-β信号通路可选择性地与MAPKs和Smad2/3信号通路作用从而促进骨前体细胞增殖、早期分化，并作用于成骨细胞。作为MKK3-p38 MAPK信号通路上游的诱导因子，TAK1和TAB1在TGF-β1调控Ⅰ型胶原蛋白表达过程中具有重要的作用。TAK1在调控MKK3和p38 MAPK蛋白水平稳定性上起着非常经典的作用。最近有研究证实，在TGF-β诱导下，Smad和p38MAPK信号通过共同作用于Runx2，从而调控MSCs前体细胞的分化。另外，细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）和p38也可分别作用于成骨细胞内的TGF-β和BMP-2的表达及功能发挥。TGF-β2诱导的ERK-MAPK是一条重要的信号通路，可通过刺激细胞增殖来增加骨祖细胞数量，从而促进骨祖细胞分化为成骨细胞，实现颅骨快速增长。目前，有关TGF-β/BMP信号通路调控骨形成代谢的相关研究较少，其分子机制尚不明确。
TGF-β信号通路与BMPs信号通路之间存在着密切的相互调控关系。TGF-β可强烈地增强BMP-2诱导的异位骨形成，其骨量是BMP-2单独诱导的5倍。体外研究发现，TGF-β1、FGF-2和血小板衍生生长因子AB（platelet derived growth factor-AB， PDGF-AB）上调BMPR-IB后可显著增强BMP-2诱导的骨形成功能。在研究BMP-9诱导C3H10T1/2细胞向成骨细胞方向进行分化时，发现BMPRⅡ和ActRⅡ是TGF-β的Ⅱ型功能受体。该研究表明，TGF-β1和BMP信号通路在成骨细胞分化过程中存在紧密的联系。BMPs在骨形成过程中的生物学作用已在很多研究中证实。研究发现，BMPs可促进小鼠骨缺失的修复。近年研究发现，在成骨细胞分化和骨形成过程中BMP信号通路与Wnt、Notch、FGF和Hh信号通路也存在密切的相互关系。
BMP-2、4、5、6和7在调控成骨细胞分化和骨形成过程中均具有重要的作用。另外，BMP-2可上调OCN表达，并且短期的BMP-2表达上调可显著促进成骨细胞分化和骨形成BMP-7可诱导成骨细胞分化标志物表达，如上调碱性磷酸酶（ALP）活性，且会加快钙离子的矿化。用Prx1-Cre模型进行体内基因研究证实，BMP-7缺失对于出生后四肢的生长和骨量的保持作用并不是很明显，提示成年骨组织内还存在其他的BMPs来弥补BMP-7缺失对骨造成的影响。而当敲除BMP-2和BMP-4后，骨形成受到显著抑制。然而，当BMP-4缺失时四肢骨形成仍然正常，提示BMP-4对于四肢骨的骨形成代谢和功能并不是必不可或缺的。小鼠四肢骨不能合成分泌BMP-2容易导致自主性骨折，即使对骨施加其他的骨形成刺激也不能弥补BMP-2缺失对骨产生的影响。在软骨发育过程中，BMP-2（而不是BMP-7）在软骨细胞增殖和成熟过程中扮演着重要的角色。有研究发现，BMP-3缺失小鼠的松质骨骨量是野生型小鼠的2倍其可抑制骨组织前体细胞分化为成熟成骨细胞，并调节成年后骨量变化。
如BMP-2的受体BMPR-Ⅱ可分别调节靶基因对BMP-2的作用，在2T3细胞内，BMPR-Ⅱ和ActR-ⅡB在功能上可相互补充以调节BMP-2信号通路和BMP-2诱导的成骨细胞分化。用Prx1-Cre技术敲除小鼠BMPR-Ⅱ后，其骨组织发育正常，提示BMPR-Ⅱ对于四肢骨的发育不是必不可少的。另一种机制与BMP与其他的Ⅱ型BMP受体相结合从而弥补了BMPR-Ⅱ敲除后对骨发育的影响。相反，当用Col1-Cre技术将BMPR-IA敲除后，小鼠的骨体积变大，四肢变短，肢体远端发育不全，身体变小，不规则钙化和低骨量等。而有研究发现，松质骨骨量的增加可能与骨保护素（osteoprotegerin， OPG）/核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand， RANKL）/核因子-κB受体活化因子（receptor activator nuclear factor-κB， RANK）信号通路抑制了破骨细胞形成有关。
Neogenin是一种膜上蛋白，在BMP诱导的经典信号通路即磷酸化Smad1/5/8过程中可通过与脂质筏相结合从而发挥其调控作用。BMP信号通路过表达可通过ALK2导致Smad1/5/8的磷酸化异常，成骨细胞特异性敲除的小鼠呈现骨质减少和BMP信号通路受到部分抑制等特征。而Smad1/5/8不能正常结合可导致严重的软骨发育异常。当Smad1被修饰后，其可调节BMP调控的骨形成，并且BMP信号通路的作用强度可被BMP受体通过Smad1的C端磷酸化来进行调控。综上，以上研究表明Smad1/5/8是成骨细胞内的信号蛋白，可被BMP诱导，从而发挥BMP信号通路的生物学调控作用。
Smad4是TGF-β和BMP信号通路唯一共有的Smad。在小鼠体内，靶向地使Smad4失去功能会导致大量的发育缺陷和多种组织上的肿瘤形成。当在小鼠体内敲除Smad4基因时，小鼠在胚胎的7.5～9.5天就会死亡，并且头部结构和前期的胚胎结构都不会形成，同时还会抑制TGF-β诱导的相关基因表达。Smad4不仅在调控TGF-β信号通路上具有重要的作用，而且在抑制肿瘤形成上也具有重要作用。成骨细胞上条件性地敲除Smad4导致骨密度降低，骨体积降低，骨形成率降低和成骨细胞数量减少。Smad4是调节骨形成的一个非常重要的靶点。研究发现，一方面，FAM和Ectodermin/Tif1 gamma（Ecto）能特异性地调节Smad的去泛素化和泛素化；另一方面，Smad6可与R-Smad竞争性地结合并与Smad4形成一个不具有生物学功能的生物复合体，而Smad4在骨形成代谢过程中会抑制BMP信号通路。Smad6在调节BMP信号通路的一个负反馈调节环路中发挥着重要的作用，并且在软骨内成骨中抑制BMP信号通路。与Smad6敲除小鼠相比，Smad6/Smurf1双敲除的小鼠表现为严重的软骨内成骨障碍。Smurf1通过其ww区域与Smad6的PY motif进行特异性结合，并将Smad6转入细胞质中。而当Smad6处于未激活状态时，主要位于核内。
经典的BMP信号通路在骨形成代谢中的重要作用已在很多研究中被证实，然而非经典的BMP信号通路在骨形成代谢中也扮演着重要的角色。TAK1可通过轻微调控BMP信号通路进而影响骨生长发育和骨形成。成骨细胞上特异性敲除Tak1后会导致锁骨发育不全，这与人体Runx2单倍不足呈现的锁骨和颅骨发育不全的表型相一致。其生物学机制与TAK1-MKK3/6-p38 MAPK磷酸化Runx2，进而促进其与调控成骨细胞基因编码的共激活剂环磷腺苷效应元件结合蛋白结合（cAMP-response element binding protein， CREB）有关。研究发现，敲除TAK1后其不仅激活p38信号级联通路，而且会激活BMP信号通路的Smad1/5/8。在BMP信号通路中，Smad和MAPK信号通路可通过协同作用调控四肢骨发育。Runx2和TGF-β/BMPs激活Smads相互之间的协调作用对于骨组织形成代谢具有重要的作用。TGF-β/BMP、MAPK信号通路和Runx2三者之间的相互调控对于促进骨形成代谢具有重要的作用。
综上，当TGF-β/BMP信号通路被激活后可通过调控其下游的Smad途径，进而入核调控相关靶基因表达来影响成骨细胞分化、成熟及成骨能力，影响骨形成代谢。
二、Wnt信号通路
Wnt信号通路不仅在胚胎发育而且在保持干细胞分化上均具有重要的调控作用，并且在诱导MSCs向成骨细胞分化和骨形成代谢过程中也扮演重要角色。Wnt信号通路主要分为经典信号通路和非经典信号通路。Wnt信号通路的研究发现，经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路在调控成骨细胞分化、成熟和骨形成代谢过程中的生物学作用存在较大的差异。
Wnt的配体包括19种分泌糖蛋白。这些配体可通过与其细胞膜上的受体结合进而诱导细胞内一系列的信号级联反应，从而调控下游靶基因的表达，发挥其相应的生物学作用。Wnt信号通路分为β-联蛋白（β-catenin）介导的经典和Ca2+、平面细胞极性（planar cell polarity， PCP）介导的非经典信号通路。β-catenin磷酸化可通过调控其下游的靶基因从而引起级联信号反应，而非经典的Wnt信号通路发挥其生物学作用是不依赖于β-catenin磷酸化的。经典Wnt信号通路的特点是以β-catenin在细胞质内的稳定和激活为主要特征。当Wnt配体不存在时，胞质内的β-catenin被糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3β， GSK-3β）、体轴抑制因子（axis inhibitor， Axin）和结肠腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli， APC）构成的蛋白降解复合体所磷酸化。GSK-3β可磷酸化β-catenin，对泛素化和蛋白小体降解过程中的β-catenin进行标记。然而，当Wnt1、Wnt3a和Wnt8等经典信号通路配体存在时，这些配体可与其共结合受体Frizzled（Fzd）结合，而低密度脂蛋白受体相关蛋白5（low density lipoprotein receptorrelatedprotein 5， LRP5）或者LRP6可引起细胞内蛋白Disheveled（Dvl）的磷酸化。在胞质内，磷酸化的Dvl可通过β-catenin磷酸化抑制GSK-3β。β-catenin磷酸化后移位进入核内，入核后的β-catenin与T细胞因子（T cell factor， TCF）/淋巴增强结合因子（lymphoid enhancer-binding factor 1， LEF）形成一个转录复合体来调节靶基因，如cyclin D1、Axin2、c-myc和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor， PPAR）等的表达进而发挥相关生物学作用。
非经典Wnt信号通路主要包括Wnt/Ca2+通路和Wnt/PCP通路。依赖Ca离子的信号通路在胚胎发育、细胞迁移和癌症进展等生物学过程中具有重要的作用。当细胞内内质网释放钙离子引起信号级联反应以及激活的G蛋白促进Wnt配体与其Fzd受体结合时，释放的钙离子可激活下游的调节因子，如蛋白酶C（protease C， PKC）、钙调磷酸酶（calcineurin， CN）和钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium-CaM-dependent protein kinase Ⅱ， CaMK Ⅱ）的表达；同时，反过来还会激活转录因子，如核因子κB（nuclear factor-kappa B， NF-κB）、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell， NFAT）和CREB等。细胞极性信号通路是另一条非经典信号通路。其在平面细胞极性、迁移、运动性和分裂等过程中具有重要的作用。这条信号通路通过Fzd受体和最终下游的物质激活（如c-jun NH2酶等）来激活小分子质量GTP结合蛋白（GTPases），如Rho、Rac和细胞分裂周期蛋白42（cell division cyclin 42， Cdc42）等。然而，目前有关非经典信号通路的生物学研究相对较少，很多机制不如经典信号通路清楚。基于激动位点的不同，经典Wnt信号通路的内源性调节因子在很大程度上可分为细胞外和细胞内拮抗剂两部分。细胞外的抑制剂包括硬骨素（sclerostin， SOST）、DKK、Wnt抑制因子1/2（Wif-1/2）和分泌卷曲-相关蛋白（secretion of curly-related proteins， SFRPs）。细胞外的拮抗剂如SOST等，主要是一些分泌因子，可与LRP5/6结合，从而抑制Wnt配体与其的作用。DKK-1同时与LRP6和另一膜上蛋白—Kremen1/2（Krm1/2）可形成一个复合物。此复合物的形成导致LRP的内在化和降解，并且还会降低LRP与Wnt配体结合的有效性。同时，SFRP和Wif-1可直接与Wnt配体集合来组织其余Fzd和LRP5/6的结合。然而，细胞内的拮抗剂扰乱了细胞质或者核内的Wnt信号通路级联反应。复合基团（由GSK-3β、Axin和APC相互结合形成）可延缓非活化情况下β-catenin的降解反应。当Chibby（Cby）被激活后，其可抑制细胞核内β-catenin和TCF/LEF-1的相互作用。这些内源性的拮抗剂应受到足够的重视。因为它们在调节Wnt信号通路的很多关键节点上起着重要的调控作用，也有助于对Wnt信号通路畸变所引发疾病机制的了解。
Wnt信号通路在调控MSCs向成骨细胞分化和骨形成代谢中均具有重要的作用。MSCs具有多种分化潜能，仍保持着分化为多种组织类型的潜能，如骨、软骨组织、脂肪、肌腱和骨骼肌等。MSCs在再生医学中具有重大的治疗潜能，因为BMSCs可从患者身体的多个部位获得，如骨髓等。当骨形成代谢紊乱时，诱导MSCs向成骨细胞系进行分化可能对于促进骨形成，改善骨代谢是一种有效的治疗方法。MSCs向单一细胞系分化过程中受到多种生长因子的调控，然而目前有关此调控过程的相关研究仍然较少。尽管如此，有关Wnt信号通路在促进BMSCs向成骨细胞分化的过程中的生物学作用已被证实。研究发现，经典Wnt信号通路可通过上调骨形成调节因子，如Runx2、同源异形盒基因5（homologous special-shaped box genes 5， Dlx5）和Osterix等并抑制脂肪形成诱导因子，如PPARγ和CCAAT/增强结合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein α， C/EBPα）等表达从而抑制BMSCs向脂肪细胞的分化。另外，研究证实，经典Wnt信号通路可通过不同的生物学机制来诱导成骨细胞分化。非经典Wnt5a配体通过抑制核染色质而不是通过激活β-catenin来抑制PPARγ表达的。然而，由Wnt配体诱导的两个独立机制之间的相互作用机制尚不清晰，而Wnt信号通路在调控BMSCs向成骨细胞分化中的生物学作用已被很多研究所证实。
三、cAMP/PKA/CREB信号通路
cAMP广泛存在于细胞内，是胞内一种重要的第二信使，其可作用于细胞膜上的特异性细胞受体，从而激活胞内的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase， AC）。在钙离子和镁离子的作用下，使得细胞内的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）转变为cAMP，再由cAMP激活下游的蛋白激酶以及相关的靶基因，从而引起下游信号的级联反应，发挥相应的生物学作用。研究证实，cAMP在舒张血管、蛋白质合成、神经细胞兴奋性、糖脂代谢及骨组织新陈代谢等多种生物学过程中扮演着重要的角色。cAMP依赖的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）由4个亚基构成，包括2个调节亚基和2个催化亚基。在cAMP不存在时，PKA以无活性的四聚体状态存在，而当PKA的2个调节亚基与cAMP相结合后，调节亚基的构象发生变化从而与催化亚基发生解离，产生2个调节亚基二聚体和2个催化亚基二聚体，以及具有生物学作用的PKA。当PKA进入核内后，其磷酸化转录细胞因子CREB，磷酸化后的CREB影响下游基因表达的功能，不仅受到本身磷酸化水平，还受到很多其他因素的影响。
PKA识别底物蛋白酶的结构特征是Arg-Arg-XSer，其中X表示任意的氨基酸残基。Komatsuzaki等研究发现，PKA磷酸化CREB后，可激活CREB的活性，并上调下游ATF4基因表达，从而发挥多种生物学作用。ATF4是一种重要的转录因子，其可通过调节下游的Runx2、Col1、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein， BSP）等表达从而在骨组织新陈代谢的过程中扮演着重要的角色。cAMP/PKA/ATF4信号通路是cAMP调控的下游信号通路之一，其在调控骨形成代谢和骨吸收代谢中具有重要的作用。cAMP可通过激活其下游的PKA，而活化后的PKA可在CREB的Ser133位点上将其磷酸化。磷酸化的CREB可上调ATF4表达，进而调控下游Col1、Runx2等基因表达，调控骨形成代谢以及骨吸收代谢。综上，cAMP/PKA/CREB信号通路是调控骨形成代谢的重要途径之一。
四、Hedgehog信号通路
Hedgehog（简称为HH）信号通路是在研究果蝇时发现的，而该信号通路中相关细胞因子的表达首先是在脊椎动物中被检测到。在哺乳动物体内，HH信号通路的同源蛋白主要有3种亚型：Sonic hedgehog（Shh）、Indian hedgehog（Ihh）和Desert hedgehog（Dhh）。Dhh主要在男性生殖系统中表达，当敲除Dhh基因后在小鼠的其他组织中并没有呈现基因被敲除后的相关表型。相反，研究却发现Shh和Ihh对于胚胎发育是至关重要的，Shh或者Ihh中任意基因的敲除，小鼠呈现多种严重的先天不足和新生儿致死率。通过基因重复突变检测发现，Ihh与Shh密切相关，其在调节软骨细胞分化和刺激软骨内骨形成过程中具有重要的作用。Ihh促进软骨细胞在生长板处的增殖和骨生长发育过程中膜内成骨的成骨细胞分化。另外，Ihh可通过Ihh—甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone related protein， PTHrP）形成负反馈调节循环来调节肥大软骨细胞分化。综上，Shh和Ihh在软骨细胞和成骨细胞分化以及骨形成代谢过程中均扮演着重要的角色。
在缺乏HH配体时，Ptc的哺乳动物同源异构体Ptch1和Ptch2在纤毛周围非常丰富。哺乳动物体内的Smo与果蝇体内的Smo相对应，其不在纤毛周围，并且不具有活性。当HH配体与Ptch1结合后，Ptch1从纤毛中退出，Smo的抑制被解除，并在初级纤毛中积累。在HH蛋白存在时，除Ptch1之外，Ptch2可通过与细胞表面的致癌基因（oncogene， CDO）、CDO（BOC）和生长抑制基因（growth suppressor gene， GAS）形成复合体。该复合体对于HH信号通路转导和级联反应起着重要作用。Cos2是哺乳动物的同源异构体，驱动蛋白家族成员蛋白7（kinesin family member 7， KIF7）在HH信号通路转导过程中起着重要的作用。神经胶质瘤相关的致癌基因家族成员（Gli1/2/3）都是Ci的哺乳动物同系物。当缺乏HH蛋白时，KIF7和PKA可使Gli3转化为Gli2；而当基于纤毛和HH信号转导被阻碍时可通过蛋白质水解处理从而形成它们的抑制剂。当HH配体存在时，Smo迁移到纤毛位置并被磷酸化，抑制PKA功能，并使KIF7和神经胶质瘤关联癌基因同源物（Gli1/2/3）-丝氨酸激酶抑制物（SUFU）复合体转移到顶部。在此过程中，KIF7在促进蛋白转运以及Gli和SuFu之间解离过程中起着重要的作用，会导致Gli2/3被激活，并且这种活化形式被转运至核内进而激活HH信号通路的靶基因，如Ptch1、Gli1和Hhip1。Ptch1是HH信号通路的靶基因，其在HH信号通路中形成了一个负反馈调控系统。在某些情况下，HH信号通路中的非经典HH信号通路并不是通过Gli转导的。
骨形成代谢主要分为软骨内成骨和膜内成骨。HH信号通路在两大骨形成代谢过程中均扮演着重要的角色。Ihh在毗邻增殖区域的肥大软骨细胞中表达。PTHrP与PTH相类似，在软骨细胞分化过程中由关节周围细胞表达。Ihh和PTHrP形成一个反馈环路来调节生长板和长骨生长发育。在关节周围软骨细胞中Ihh刺激PTHrP的表达。而当PTHrP下降并低于某一水平时，软骨细胞将从细胞循环中退出，并经历肥大过程。当抑制HH信号通路时，抑制成骨细胞分化使得软骨内细胞分化丢失。BMPs、FGFs和机械载荷对于这个反馈环路均具有重要的作用。
HH信号通路调控软骨内骨形成，Gli2和Gli3调控骨骼发育，而Gli1作用不显著。而Gli1在骨形成中可协同的与Gli2和Gli3来发挥作用。敲除Gli3后可使Ihh敲除后的小鼠肥大软骨细胞保持应有的表型，而当不存在Ihh时，删除Gli3和激活Gli2会上调Runx2表达。HH信号通路可通过调控下游Wnt/β-catenin途径、胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor-2， IGF-2）介导的mTORC2-Akt途径等来调控成骨细胞分化，并且BMP-2和核心结合因子-β（core binding factor beta， Cbfβ）可通过激活HH信号通路来促进软骨细胞分化及软骨内骨形成。目前，有关HH信号通路调控软骨细胞增殖分化和成骨细胞分化的相关研究较多，提示HH信号通路在骨形成代谢中的软骨内骨形成过程中扮演着重要角色。
HH信号通路不仅在软骨内成骨中起着重要的作用，而且在由成骨细胞主导的膜内成骨中也扮演着重要的角色。Ihh-/-小鼠颅骨区域面积、厚度和矿化能力等均显著降低，人字缝宽度扩大。研究发现，在日益增长的颅骨边缘的Ihh表达上调可通过调节成骨分化而不是骨增殖促进骨形成。目前，有关HH信号通路介导成骨细胞增殖分化进而调控膜内成骨的相关研究较少，尚待深入研究。
五、Notch信号通路
Notch信号通路是在进化上十分保守的信号通路，其在发育过程中的细胞命运和形成模式上具有重要的作用。另外，在细胞分化、增殖和细胞凋亡、血管再生、骨组织新陈代谢等生物学过程中也起着重要的作用。NOTCH1-4受体均是单向的跨膜蛋白，其可被δ（Delta）（DLL1/3/4）和Jagged/Serrate（JAG1/2）配体激活。以上所有蛋白在发育过程中都呈现细胞类型和组织特异性表达等特点。这个配体-受体的相互作用导致蛋白质水解裂解，并释放NOTCH细胞内区域（NOTCH domain in cell， NICD），并释放进入核内，在功能重组信号序列结合蛋白（RBP-JK）转录因子的调控下（包括大量靶基因的表达）使其与DNA相互作用。Notch1是4个Notch受体中的一个受体，是一个被配体激活的膜上受体，其在很多组织中通过细胞与细胞之间的相互作用来调控细胞分化等。多毛和split-1的增强剂（hairy and enhancer of split-1， HES-1）是Notch1下游的效应器，在很多研究中已被证实其在决定细胞命运中是Notch信号通路的主要靶基因。HES1是Notch1的一个活性标志物，常被用来检测Notch1信号通路是否被激活。Notch信号通路与骨组织代谢存在密切的关系，其可促进关节软骨形成、软骨骨化和生长板增加，并在成骨细胞分化等过程中也具有重要的作用。HES高表达可加快骨形成代谢以及刺激OPN和Ⅰ型胶原蛋白等骨形成标志基因的表达。近来的研究也发现，Notch信号通路在调控MSC向成骨细胞分化和骨形成代谢上也具有重要的作用。目前，有关Nocth信号通路调控MSCs向成骨细胞分化的相关研究在国内外较多，但主要集中在体外研究上，而在动物体内研究中有关Notch信号通路调控成骨细胞分化和骨形成代谢的相关研究还鲜有报道，很多生物学机制尚不清晰，值得深入研究。