第六章 胆道闭锁免疫学特点
胆道闭锁（biliary atresia，BA）是新生儿胆汁淤积的常见原因，其病理特征表现为肝内外胆管的进行性炎症和肝纤维化。虽然外科手术（Kasai手术）可以通过肝肠吻合术重建胆汁排泄通路，改善胆道梗阻状况，但术后肝内胆管的进行性免疫炎症并未能完全阻止，肝纤维化仍在进展，约有40%~50%的患儿在成年以前发展至肝硬化，最终需要进行肝移植。
BA的病因和病理过程目前尚不清楚，从而影响BA的预防和治疗策略。目前研究认为BA的发生可能与遗传因素、病毒感染、免疫损伤、外源性毒素侵袭等多种因素有关。由病毒感染而引发胆管上皮自身免疫损伤已成为BA发病原因的主流学说，在此过程中遗传易感性也起到了一定的作用。病毒感染可能通过以下一些途径触发自身免疫应答：病毒感染或外源性的毒素侵入，导致胆管上皮产生新的抗原或其自身抗原发生改变，或病毒蛋白与胆管上皮细胞蛋白结构相似，产生“分子模拟”现象。这种新的或者改变了的抗原多肽通过与抗原递呈细胞中的人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）Ⅱ类分子组成复合体呈递给未分化的辅助T淋巴细胞（Th0）。Th0细胞激活后，分化为Th1或Th2细胞并分泌一些细胞因子引发一系列的免疫反应。
胆道闭锁胆管损伤的免疫反应包括固有免疫和适应性免疫，两者在疾病的发生发展过程中错综复杂，相互交织。固有免疫包括巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞，其中树突细胞和巨噬细胞作为适应性免疫的基础分子，将固有免疫系统和适应性免疫系统连接在一起，树突细胞、巨噬细胞和B细胞将抗原递呈给T细胞使之活化。适应性免疫对二次暴露的病原体及抗原产生免疫应答，包括T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫。
一、胆道闭锁与固有免疫
病毒感染激活人体固有免疫系统，释放肿瘤坏死因子（TNF-α、IL-1、IL-6）等炎性介质，迅速产生非特异性炎症反应。巨噬细胞参与固有免疫和适应性免疫，BA患儿肝脏汇管区巨噬细胞和Kupffer细胞大量浸润，数量增多，体积增大，血浆中巨噬细胞产物IL-18水平增高，后者与IL-12在炎症反应中促进Th1细胞分化。在巨噬细胞相关基因多态性研究上，BA患儿CD14/159基因启动子T等位基因和T/T纯合子显著增加。T/T纯合子与单核细胞CD14表达增强相关，CD14是巨噬细胞表面糖蛋白，能够识别内毒素和激活TNF-α，在病毒感染的调控方面发挥重要作用。循环血中可溶性CD14是中和内毒素重要的介质，巨噬细胞通过CD14启动子多态性过度激活引起机体固有免疫过度反应，从而导致胆管损伤。固有免疫系统包括两种主要的受体：膜结合受体TLR和胞质核苷酸结合寡聚结构域受体，统称为模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）。PRR不仅在固有免疫细胞表达，而且在胆管上皮细胞表达。PRR可以识别感染细胞的病原相关分子（pathogen associated molecular pattern，PAMP），包括脂多糖、脂蛋白、dsRNA和单链病毒RNA（ssRNA）。Saito等发现BA患儿肝脏组织中TLR8表达上调，接受肝移植的BA患儿肝脏TLR3和TLP7水平较没有接受肝移植的BA患儿显著升高，而这些TLP既是双链RNA（dsRNA）也是单链RNA（ssRNA）受体。另一项研究发现，与胆总管囊肿患儿相比，BA患儿TLR7水平增高，免疫组化显示TLR7在胆管上皮、Kupffer细胞和中性粒细胞中表达增强。TLR7是病毒ssRNA受体，并通过MxA信号分子进一步激活干扰素-1（IFNs-1）。胆管上皮细胞在固有免疫当中通过TLR3通路诱导凋亡，导致胆管阻塞。BA患儿的胆管上皮细胞表达TLR3，后者能够识别呼吸道肠道病毒等dsRNA，dsRNA促进胆管上皮产生MxA和IFNs-1，上调TNF相关凋亡诱导配体的表达，诱导胆管细胞凋亡。研究认为BA的固有免疫是一个持续不断的应答反应过程，不会产生耐受而停止，最终导致慢性炎症，胆管上皮细胞受损害。
二、胆道闭锁与适应性免疫
（一）胆道闭锁与细胞免疫
研究认为参与BA的细胞免疫以汇管区浸润的CD4+和CD8+T细胞为主，T淋巴细胞激活后产生Th1细胞因子IL-2，IFN-γ和TNF-α。这些细胞侵入胆管上皮细胞之间，引起肝内胆管损伤。T细胞高度活化，表达细胞表面标志物CD71，激活CD25和淋巴细胞功能相关抗原1。对BA肝脏和肝外胆管T细胞受体可变区研究揭示T细胞是寡克隆，提示BA患儿T细胞只对病毒蛋白或胆管上皮蛋白等特异性抗原发生增殖反应。利用基因芯片技术在BA患者肝穿刺组织中检测到IFN-γ等促纤维基因。IFN-γ是一种重要的免疫调节基因，小鼠感染恒河猴轮状病毒（RRV）一周后，汇管区的CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α，感染两周后出现CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞浸润。
细胞因子产生和激活通常定位于靶器官，但炎症加重时细胞因子产生增加，可进入血液循环，从而可以在血浆中检测。为了识别BA血浆中生物标记物，Narayanaswamy等连续检测Kasai手术患儿血浆中Th1（IL-2、IFN-γ），Th2（IL-4、IL-10）和巨噬细胞细胞因子（IL-18，TNF-α）以及黏附分子（ICAM-1、血管细胞黏附分子）。除IL-10外，其余所有细胞因子和黏附分子血浆内含量在术后6个月内均升高，提示炎症过程仍在进展，没有因手术而改善。可溶性细胞间黏附分子（sICAM-1）可能作为提示疾病严重程度的生物标记物，血浆中sICAM-1水平与胆红素水平呈正相关，在术后第一年里，血浆高水平的sICAM-1预示可能需要肝移植。以前发现ICAM-1在BA肝组织中表达上调，近期的研究表明BA血浆中sICAM-1水平也升高。对ICAM-1基因多态性进行分析，发现ICAM G241R多态性与BA显著相关，提示多态性在BA发病机制中发挥一定作用。ICAM-1作为黏附分子，表达于炎症部位的多个细胞系，通过内皮细胞介导白细胞和粒细胞迁移，促进抗原特异性T细胞增殖。年长BA患儿（中位数为9岁）血清IL-18和IFN-γ显著升高，IL-18水平与黄疸严重程度相关。IL-18与IL-12协同作用，促进Th1细胞分化，从而产生干扰素。Dong等发现BA组患儿血清IL-33水平较对照组显著升高，而且升高程度与γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）水平呈相关性。此外在肝活检标本中IL-33mRNA和蛋白水平也较对照组升高，发现提示IL-33过表达可能在BA炎症损伤中发挥重要作用。
利用基因表达微阵列技术分析，发现包括干扰素和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等促炎症基因子在BA活检肝组织中水平上调。OPN是由多种细胞类型分泌的Th1型细胞因子，在免疫细胞聚集到炎症部位以及细胞外基质形成和纤维化中起关键作用。OPN在BA肝组织胆管上皮细胞中表达增强，与肝脏胆管增生和纤维化相关。此外，在OPN与NF-B（上游转录因子激活OPN）及TGF-β（下游效应分子与纤维化）之间存在正相关。OPN水平上调在BA中持续存在，年长BA患儿（平均年龄，8.2岁）的血浆OPN水平也明显高于对照组，而持续性黄疸或门静脉高压患者的OPN水平最高。
（二）胆道闭锁与体液免疫
体液免疫应答是由B细胞对特定抗原识别启动的，B细胞克隆的活化和增殖，在效应阶段分泌抗体吞噬抗原。婴儿出生时几乎所有的IgG都是来源于母体，在出生后前3~6周，IgG呈指数下降，在1.5~3个月达到最低点。这正是新生儿IgG开始合成的时间点，直到5岁才达到成人IgG水平。相反，IgM抗体水平在生命最初几个月迅速上升，到1岁时达到成人水平的75%。研究发现新生儿存在“天然自身抗体”，这些新生儿IgM对选择性的自身抗原做出反应，其中许多是自身免疫性疾病自身抗原的目标，这是由于在IgM抗体库中包含了一些主要疾病相关的自体抗原，在其他良性“自然”自身免疫调节时出现失误，导致病理性的自体免疫性疾病。引发“良性自身免疫失误”的原因包括病毒感染或环境毒素。
有关BA体液免疫自身免疫的报告很少。Feldman等用恒河猴轮状病毒（RRV）诱导的野生型和B细胞缺陷型（Ig-α-/-）2组BA小鼠模型，发现B细胞缺陷组较野生型组小鼠在无BA疾病生存方面有明显差异（76.8%vs 17.5%），B细胞缺陷组小鼠没有发生胆道梗阻或高胆红素血症，肝脏的炎症因子及Th1细胞相关因子的表达均低于野生型组，这说明B细胞介导的体液免疫在BA发病中具有重要作用。Hadchouel等发现IgM和IgG在128例BA患儿当中的44例肝外残留胆管上皮细胞基底膜上沉积。在年龄较大BA患儿肝脏标本汇管区也证实了IgG沉积。关于血清自身抗体存在的数据也很少。Vasiliauskas等报道11例胆道闭锁患者中有10例血清IgG和IgM抗中性粒细胞胞浆抗体阳性，与其他肝脏疾病相比，BA患儿血清IgM抗中性粒细胞胞浆抗体水平更高。Lu等发现，40%BA血清样本IgM和IgG抗烯醇化酶抗体有显著升高。抗烯醇化酶抗体已经在包括自身免疫性肝病在内的其他自身免疫性疾病中发现，提示该抗体可能是自身免疫性疾病的非特异性标记。但目前研究样本量较少，并且使用兔肌肉烯醇化酶而不是人烯醇化酶作为ELISA研究的抗原来源，两者仅具有80%物种间的同源性。Mack等在体液免疫的研究中发现RRV诱导的BA小鼠的肝脏汇管区有免疫球蛋白沉积，并通过Western bolt检测发现针对胆管上皮细胞来源的多种抗体，推测可能有针对胆管上皮的自身抗体的存在。他们的研究小组在后来的研究中还发现BA小鼠模型血清中存在针对胆管上皮细胞的抗体，并通过质谱分析发现与抗体发生特异性反应的胆管上皮细胞抗原为α-烯醇酶（α-enolase）。通过enolase和病毒蛋白抗体的交叉实验以及enolase与轮状病毒编码的蛋白具有相似的氨基酸序列推测分子模拟现象可能是其抗体产生的原因。
（三）胆道闭锁的免疫失调
在上述炎症反应过程中，免疫调节T细胞（Treg）起了重要的调控作用，出生第1天小鼠体内免疫调节T细胞极少，腹腔注射轮状病毒后小鼠肝脏中免疫调节T细胞也没有增加。但给出生后第7天的小鼠注射轮状病毒后，免疫调节T细胞迅速增加至10倍以上。体内免疫调节T细胞的过继转移可以减轻胆汁淤积和胆管损害，当体内免疫调节T细胞减少时，胆管损害增加，同时观察到肝脏CD8+细胞增加并且对树突细胞刺激的能力增强。识别Treg细胞的转录因子Foxp3+在感染轮状病毒小鼠肝脏中的百分比和绝对数量均显著下降，但在小鼠脾脏中却没有变化，提示Treg细胞在感染小鼠肝脏中的运输或归巢过程中存在缺陷，从而导致特异性活性分子如CD25、黏附分子（CD44、CD62L）表达下降。新生儿出生后调节性T细胞显著增加，5天可达到成人水平。调节性T细胞可阻止自身反应性T细胞的激活，BA患儿调节性T细胞的数量或功能缺陷会使炎症过度发展。外周血Treg定量显示，BA患儿的Treg频率显著低于对照组，在对CMV呈阳性反应的BA患者中更明显。在BA患儿中，调节性T细胞的大量减少会导致炎症或自身免疫反应的抑制作用下降，从而导致胆管损伤。
（四）胆道闭锁的细胞自身免疫
BA胆道损伤过程可以用自体免疫介导的“旁观者”激活途径解释。胆管受到病毒损害后，受损的胆管上皮细胞可表达“自我”抗原，诱导自身反应性Th1细胞介导的炎症反应，B细胞产生针对胆管上皮细胞的自身抗体。另外，病毒蛋白在结构上可能与胆管上皮蛋白相似，并可能通过分子模拟引起细胞和/或体液自身免疫。分子模拟需要T或B细胞对微生物抗原产生反应，同时对自身抗原具有交叉反应。对小鼠的研究已证实，自身反应性T细胞和自身抗体均靶向胆管上皮细胞。对于人类的研究只有间接证据证实胆道闭锁发病存在自身免疫损伤。胆道闭锁患儿胆管上皮细胞主要组织相容性复合体Ⅱ类（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）异常表达，HLAⅡ类DR在肝内外胆管上皮细胞表达增强。有关HLA与BA的关联已有报道，结果并不一致。一项欧洲研究对101名BA患儿进行了HLA基因型分析，发现与对照组相比没有显著差异。相比之下，日本一项对392例BA研究发现BA和HLA-DR2之间存在显著的关联，以及与高频率的hla-a24-b52-dr2.65连锁失衡。
总之，BA是导致儿童肝移植的主要疾病，病因及发病机制仍不明确，先天性和适应性免疫在BA胆管损伤机制中具有重要作用，多种免疫细胞和细胞因子参与其中，导致肝内外胆管持续性的免疫损伤。了解BA发生的免疫机制，阻断进行性的免疫损伤，从而减缓疾病的进展，可改善BA患儿的预后。
（李乐 余家康）
参考文献
[1]SCHWARZ KB, HABER BH, ROSENTHAL P, et al. Extrahepatic anomalies in infants with biliary atresia: results of a large prospective North American multicenter study[J]. Hepatology, 2013, 58: 1724-1731.
[2]MIRZA B, IQBAL S, SHEIKH A. Biliary atresia associated with polysplenia syndrome, situs inversus abdominus, and reverse rotation of intestine[J]. APSP J Case Rep, 2012, 3: 14.
[3]JIMENEZ-RIVERA C, JOLIN-DAHEL KS, FORTINSKY KJ, et al. International incidence and outcomes of biliary atresia[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2013, 56: 344-354.
[4]NAKAMURA K, TANOUE A. Etiology of biliary atresia as a developmental anomaly: recent advances[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2013, 20: 459-464.
[5]TUCKER RM, FELDMAN AG, FENNER EK, et al. Regulatory T cells inhibit Th1 cell-mediated bile duct injury in murine biliary atresia[J]. J Hepatol, 2013, 59: 790-796.
[6]PETERSEN C, DAVENPORT M. Aetiology of biliary atresia: what is actually known[J]. Orphanet J Rare Dis, 2013, 8: 128.
[7]ALVAREZ F. Is biliary atresia an immune mediated disease[J]. J Hepatol, 2013, 59: 648-650.
[8]SHIH HH, LIN TM, CHUANG JH, et al. Promoter polymorphism of the CD14 endotoxin receptor gene is associated with biliary atresia and idiopathic neonatal cholestasis[J]. Pediatrics, 2005, 116: 437-441.
[9]LANE T, LACHMANN HJ. The emerging role of interleukin-1beta in autoinflammatory diseases[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2011, 11: 361-368.
[10]HARADA K, NAKANUMA Y. Cholangiopathy with respect to biliary innate immunity[J]. Int J Hepatol, 2012, 20（12）: 793569.
[11]SAITO T, HISHIKI T, TERUI K, et al. Toll-like receptor mRNA expression in liver tissue from patients with biliary atresia[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2011, 53: 620-626.
[12]HUANG YH, CHOU MH, DU YY, et al. Expression of toll-like receptors and type 1 interferon specific protein MxA in biliary atresia[J]. Lab Invest, 2007, 87: 66-74.
[13]HARADA K, SATO Y, ITATSU K, et al. Innate immune response to double-stranded RNA in biliary epithelial cells is associated with the pathogenesis of biliary atresia[J]. Hepatology, 2007, 46: 1146-1154.
[14]MACK CL, TUCKER RM, SOKOL RJ, et al. Biliary atresia is associated with CD4+Th1 cell-mediated portal tract inflammation[J]. Pediatr Res, 2004, 56: 79-87.
[15]ZHENG S, ZHANG H, ZHANG X, et al. CD8+T lymphocyte response against extrahepatic biliary epithelium is activated by epitopes within NSP4 in experimental biliary atresia[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014, 307: G233-240.
[16]GUO C, ZHU J, PU CL, et al. Combinatory effects of hepatic CD8+and NK lymphocytes in bile duct injury from biliary atresia[J]. Pediatr Res, 2012, 71: 638-644.
[17]MACK CL, FALTA MT, SULLIVAN AK, et al. Oligoclonal expansions of CD4+and CD8+T-cells in the target organ of patients with biliary atresia[J]. Gastroenterology, 2007, 133: 278-287.
[18]AHMED AF, OHTANI H, NIO M, et al. CD8+T cells infiltrating into bile ducts in biliary atresia do not appear to function as cytotoxic T cells: a clinicopathological analysis[J]. J Pathol, 2001, 193: 383-389.
[19]SHIVAKUMAR P, SABLA G, MOHANTY S, et al. Effector role of neonatal hepatic CD8+lymphocytes in epithelial injury and autoimmunity in experimental biliary atresia[J]. Gastroenterology, 2007, 133: 268-277.
[20]BEZERRA JA, TIAO G, RYCKMAN FC, et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia[J]. Lancet, 2002, 360: 1653-1659.
[21]NARAYANASWAMY B, GONDE C, TREDGER JM, et al. Serial circulating markers of inflammation in biliary atresia—evolution of the post-operative inflammatory process[J]. Hepatology, 2007, 46: 180-187.
[22]BROOME U, NEMETH A, HULTCRANTZ R, et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler’s disease[J]. J Hepatol, 1997, 26: 857-862.
[23]FENG J, LI M, GU W, et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune electron microscopy study[J]. J Pediatr Surg, 2004, 39: 1658-1662.
[24]GHONEIM EM, SIRA MM, ABD ELAZIZ AM, et al. Diagnostic value of hepatic intercellular adhesion molecule-1 expression in Egyptian infants with biliary atresia and other forms of neonatal cholestasis[J]. Hepatol Res, 2011, 41: 763-775.
[25]ARIKAN C, BERDELI A, KILIC M, et al. Polymorphisms of the ICAM-1 gene are associated with biliary atresia[J]. Dig Dis Sci, 2008, 53: 2000-2004.
[26]VEJCHAPIPAT P, POOMSAWAT S, CHONGSRISAWAT V, et al. Elevated serum IL-18 and interferon-gamma in medium-term survivors of biliary atresia[J]. Eur J Pediatr Surg, 2012, 22: 29-33.
[27]DONG R, DONG K, WANG X, et al. Interleukin-33 overexpression is associated with gamma-glutamyl transferase in biliary atresia[J]. Cytokine, 2013, 61: 433-437.
[28]HONSAWEK S, VEJCHAPIPAT P, CHONGSRISAWAT V, et al. Association of circulating osteopontin levels with clinical outcomes in postoperative biliary atresia[J]. Pediatr Surg Int, 2011, 27: 283-288.
[29]HOLLADAY SD, SMIALOWICZ RJ. Development of the murine and human immune system: differential effects of immunotoxicants depend on time of exposure[J]. Environ Health Perspect, 2000, 3: 463-473.
[30]MERBL Y, ZUCKER-TOLEDANO M, QUINTANA FJ, et al. Newborn humans manifest autoantibodies to defined self molecules detected by antigen microarray informatics[J]. J Clin Invest, 2007, 117: 712-718.
[31]FELDMAN AG, TUCKER RM, FENNER EK, et al. B cell deficient mice are protected from biliary obstruction in the rotavirus-induced mouse model of biliary atresia[J]. PLoS One, 2013, 8: e73644.
[32]HADCHOUEL M, HUGON RN, ODIEVRE M. Immunoglobulin deposits in the biliary remnants of extrahepatic biliary atresia: a study by immunoperoxidase staining in 128 infants[J]. Histopathology, 1981, 5: 217-221.
[33]VASILIAUSKAS E, COBB L, VIDRICH LA, et al. Biliary atresia-an autoimmune disorder[J]. Hepatology, 1995, 22: 87.
[34]LU BR, BRINDLEY SM, TUCKER RM, et al. alpha-enolase autoantibodies cross-reactive to viral proteins in a mouse model of biliary atresia[J]. Gastroenterology, 2010, 139: 1753-1761.
[35]MACK CL, TUCKER RM, LU BR, et al. Cellular and humeral autoimmunity directed at bile duct epithelia in murine biliary atresia[J]. Hepatology, 2005, 44: 1231-1239.
[36]LAGES CS, SIMMONS J, CHOUGNET CA, et al. Regulatory T cells control the CD8 adaptive immune response at the time of ductal obstruction in experimental biliary atresia[J]. Hepatology, 2012, 56: 219-227.
[37]DONALDSON PT, CLARE M, CONSTANTINI PK, et al. HLA and cytokine gene polymorphisms in biliary atresia[J]. Liver, 2002, 22: 213-219.
[38]YUASA T, TSUJI H, KIMURA S, et al. Human leukocyte antigens in Japanese patients with biliary atresia: retrospective analysis of patients who underwent living donor liver transplantation[J]. Hum Immunol, 2005, 66: 295-300.