第三节　激光分子荧光光谱分析法

在普通的分子荧光光谱分析中常用高压汞蒸汽灯或氙弧灯作光源。高压汞灯的谱线强度（图10-8）相差悬殊，在分子荧光分析中最常用的是365.0nm的谱线，其次是405.0nm和436.0nm的谱线。激发只能限于少数波长，不能满足各种待测物质激发的需要。氙弧灯所发射的谱线强度大，并且是连续光谱（250～700nm），在300～400nm范围内所有的谱线强度几乎相等。但在紫外区输出功率较小，只有用大功率的氙弧灯才能显著提高其在紫外区的输出，而大功率的氙弧灯无论是稳定性还是热效应都存在许多亟待解决的问题。

采用激光作为激发光源可以克服以上缺点，该方法又称为激光诱导荧光光谱分析法。尤其是可调谐激光器的使用，以及激光光源和微弱信号检测技术在荧光分析中的应用，使激光诱导荧光光谱分析法成为检测痕量物质的高灵敏方法，其检测限已达到分子光谱分析的灵敏度极限——单分子检测。

一、激光紫外-可见分子荧光光谱分析法

利用激光具有高强度的特性，采用激光器作为激发光源可大大提高荧光测定的灵敏度。例如分别用激光荧光法和普通荧光法测定维生素A等待测物质，前者检出限约比后者低两个数量级。采用激光分子荧光分析法对水中的多环芳烃进行含量测定，检出限达到ppt量级。例如采用273nm的激光作为激发光，在发射波长为395nm对芘进行测定，检出限达2.5×10-12mol/L。

由于激光单色性好，可聚成很小的光斑（φ10～100μm），可极大地减少样品的用量，用零点几微升就可进行荧光分析。如分析生物器官中组分的含量，甚至单细胞乃至单细胞核内组分的含量，这在生命科学的研究中特别重要。

对于含量极低的生化样品如维生素、氨基酸、酶、蛋白质、激素等，要获得较大的荧光信号必须采用高强度的激发光源，在高功率激光的照射下有可能导致样品热分解。若采用脉冲激光器作激发光源，其峰值功率大，可产生较强的荧光信号。由于激光脉冲持续时间短、平均能量低，可避免样品组分的分解。

除了对液体样品进行分析外，激光分子荧光法还可对气体样品进行分析。例如用Ar+激光器（488.0nm）为激发光源，对NO₂进行测定，检测限可达1μg/m3；用倍频闪光灯激励的染料激光器为激发光源（326.2nm），对空气中甲醛进行测定，检测限可达50μg/m3。

激光荧光法对游离基的检测也具有重要意义。例如，痕量OH·自由基对上层大气的光化学反应起着重要作用，同时又是光化学烟雾的重要中间产物。质谱法检测OH·自由基易受大气中水分的影响，而激光荧光法则可消除干扰并获得很高灵敏度。

二、激光红外荧光光谱分析法

物质分子吸收辐射光的能量后发生自发跃迁的概率和辐射光的频率有关。频率越高（即能量越大），自发跃迁的概率越大。红外光的能量比紫外-可见光小，所以物质分子在紫外-可见区自发跃迁的概率较大，而在红外区自发跃迁的概率较小。当物质分子吸收了红外光后，被激发到较高的振动能级，在从寿命较长的激发态返回基态的过程中，很容易通过相互之间的碰撞把能量以热辐射的形式传递给其他分子，导致红外区的荧光效率很低。特别是溶液或液体中的分子更是如此。因此，吸收了红外光的分子若用普通光源激发，由于荧光信号非常微弱，难以检测。

因为荧光强度与入射光强度呈正比，所以用大功率的红外激光器作光源，可产生较强的红外荧光。

激光红外荧光光谱的测定装置主要由激光器、样品池和红外分光光度计三部分组成（图10-9）。激光器一般用大功率的二氧化碳激光器；样品池通常由普通玻璃制成，三个红外窗用的是红外材料，如KBr、AgCl、艾尔特蓝-Ⅱ等，其中以艾尔特蓝-Ⅱ最好；红外分光光度计包括单色器和检测器等主要部件。激光光束通过样品池的红外窗口，激发气体样品，产生的红外荧光通过与激光光束垂直的红外窗口进入红外分光光度计，对红外荧光进行扫描，得到红外荧光光谱。在红外荧光波峰处测定荧光强度，可进行定量分析。

以二氧化碳激光器（10.6μm）作光源，测定了40多种化合物的红外荧光光谱，结果发现大多数化合物的红外荧光光谱的大部分波峰与其红外吸收光谱的波峰接近，一般仅相差20～30cm-1。这表明它们的红外荧光光谱具有特征性，可用于研究化合物的分子结构。

尽管激光红外荧光光谱分析法还不够完善，但因其具有高的灵敏度和选择性，对环境样品中有毒有害物质的检测具有一定的应用价值，尤其是在遥测环境污染物的激光雷达技术中起着重要作用。

三、激光低温荧光光谱法

溶液中的环境因素对分子荧光会产生显著影响，尤其是温度。一般荧光光谱法是在室温下进行的，荧光光谱为带状光谱。由于各种变宽因素的影响，谱带往往较宽并容易相互重叠，使得许多化学结构颇为相近的异构体和衍生物的荧光分析很难进行。

随着温度的降低，介质的黏度增大，荧光分子与溶剂的碰撞机会及分子的内部能量转化作用将大大减少，荧光物质的量子产率将增高，荧光强度将增大，分子的吸收光谱和荧光光谱在低温下窄化，由宽峰光谱变为线状光谱。所以在低温等特殊条件下，荧光物质可产生荧光光谱的精细结构——“准线状光谱”，从而可实现对样品中荧光物质的“指纹识别”，甚至实现混合物中某些特定组分的定量测定。

低温荧光法和室温荧光法相比，由于光谱带宽的窄化，在选择性上得到了根本性的突破，不足之处在于需要低温设备，且有的方法对溶剂有严格的要求，使其应用范围受到一定限制。

激光低温荧光光谱法可分为Shpol’skii荧光光谱法、基体隔离光谱法、荧光窄线光谱法、超声喷射光谱法等，它们被称为分子光谱的“指纹识别法”，在环境、毒理等领域中多用于多环芳烃及其异构体和代谢物的测定。

1.激光Shpol’skii荧光光谱法

激光Shpol’skii荧光光谱法是将Shpol’skii光谱和激光荧光结合起来的一种高分辨率的光谱分析方法。Shpol’skii光谱的基础是Shpol’skii效应。Shpol’skii效应于1952年由苏联科学家Shpol’skii提出。在足够低的温度下，多环芳烃被急速冷冻在正烷烃溶剂中，溶质分子嵌入到结晶溶剂的晶格中并有严格的取向，分子之间的相互作用、分子的振动能、转动能及热展宽效应大大减少而产生了精细的准线性光谱，得到各种PAHs的指纹信息，这种在低温正烷烃溶剂中多环芳烃化合物谱线变窄的现象叫做Shpol’skii效应。产生的光谱称为Shpol’skii光谱。

Shpol’skii效应并不普遍存在，只有在溶质分子和溶剂分子的线性尺寸和几何关系相匹配的情况下才能发生（图10-10），即溶剂和溶质分子的大小和空间构型应符合“锁和钥匙”的关系。如用光源照射处于低温（10～15K）下的苯并［a］芘乙醇溶液，可观察到一宽带的吸收光谱和荧光光谱，谱线宽度约500cm-1；如果在相同的低温条件下，用光源照射苯并［a］芘的正庚烷溶液，则发现其吸收光谱和荧光光谱呈线状，线宽约为10cm-1。

用窄带的激光光源选择性激发，谱线宽度可进一步变窄，使得荧光光谱的分辨率大大提高，特别适用于多环芳烃混合物的定性和定量分析。有报道尿和血中1-羟基苯并［a］蒽的检出限可达12fg。在实际操作中，溶质浓度、溶质在匹配溶剂中的溶解度及冷冻速率对Shpol’skii光谱都会产生影响。

2.激光激发的荧光窄线光谱法

在低温下用宽度为1～2cm-1的狭窄激光线激发在有机玻璃体中的待测物质可得到锐线的荧光光谱，这种方法称为荧光窄线法。荧光窄线光谱的发生有两个主要条件：一个是上述激发波长和溶质分子的纯电子跃迁配合，另一个条件是温度必须足够低，介质温度一般低于20K，常用温度4K左右。由于有机玻璃基体透明，具有优良的光学性质，能够把激光散射减至最小，而且有机玻璃基体容易制备，均匀性等性能优良，所以该方法一般采用有机溶剂和水组成的有机玻璃体作介质。该技术已用于水样和其他基质中多环芳烃及其代谢物的定性和定量分析及其致癌机制的探讨。

激光激发的荧光窄线光谱技术的特点是：①选择性很好，但灵敏度低于激光激发Shpol’skii荧光法。②不要求溶质分子与溶剂分子之间一定要匹配，可供选择的基体范围较宽，其应用比Shpol’skii法更灵活广泛。

3.激光基体隔离荧光光谱法

激光基体隔离荧光光谱法是一种将低温基体隔离技术与激光荧光相结合的高分辨光谱分析方法。低温基体隔离（matrix isolation）技术是将固体或液体样品气化，然后与大量（物质的量比为105～108）的稀释气体即基体混合，气体混合物接触并沉积在低温（11～15K）光学窗口上进行荧光测定。N₂或Ar化学性质不活泼，在测量的波长范围内不吸收，是适宜的稀释气体。通过低温基体隔离技术，所有的样品分子都均匀地分布在基体分子之间，基体分子起到隔离样品分子的作用，它们与基体的相互作用很弱，并且在低温下热展宽效应明显降低，因而对光谱的干扰作用大大降低。

4.基体隔离Shpol’skii荧光光谱法

基体隔离Shpol’skii荧光光谱法是用正链烷烃作基体物质，先把样品分子隔离在沉积的正链烷烃中，然后加热到溶剂的特征温度，短时间“退火”，再冷却至低温进行荧光测定。该方法结合了Shpol’skii荧光光谱法分辨率高和基体隔离荧光光谱法线性范围宽的特点，获得更好的测定效果。如多环芳烃的检测，可采用正庚烷作隔离基体，先将正庚烷溶液气化，沉积在15K镀金的铜表面上，得到无定形固体，然后加热到145K，退火5分钟，再降至15K进行测定。这样获得的荧光光谱和Shpol’skii荧光光谱一样具有高的分辨率。

上述四种方法的共同之处在于，尽管采用不同方法，但目的都是尽最大可能排除发光光谱中引起谱带变宽的主要因素来进行荧光测定。在实际应用中，这些低温荧光法又各有特点。激光Shpol’skii荧光光谱法具有分辨率高的特点；荧光窄线光谱法因为不需要特殊的溶剂和溶质几何关系，可使用的基体多，应用范围更广；基体隔离荧光法在定量分析中得到的线性工作范围和精密度优于冷冻溶液Shpol’skii荧光法。实际应用分析中冷冻溶液Shpol’skii荧光光谱法和荧光窄线光谱法最为常用。

四、激光时间分辨荧光分析法

激光时间分辨荧光分析法是利用目标物荧光寿命特性实现其鉴别、分析的一种方法。用很短的脉冲激光激发荧光体，停止激发时，对荧光强度进行时间扫描，可得荧光体的荧光衰减曲线。其衰减曲线方程为：

式中，I_t为时间t时的荧光强度；I₀为最大荧光强度，即t=0时的荧光强度；τ为荧光寿命，即荧光强度降为最大荧光强度的1/e时的时间。图10-11给出荧光强度随时间的变化规律。

荧光寿命τ是表示荧光体的荧光持续时间长短的特征时间常数，是研究分子激发态弛豫的一个重要物理量，不同荧光体具有不同的荧光寿命，据此可区分不同的化合物。大多数芳香化合物和生物大分子的荧光寿命在1～100nm数量级范围。

时间分辨荧光光谱技术既可消除瑞利散射和拉曼散射的干扰，也可根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组分进行测定。例如，室温时蒽和芘的荧光光谱重叠，但蒽的荧光寿命为10纳秒，芘的荧光寿命为200纳秒，用时间分辨荧光光谱技术对二者进行测定可取得良好效果。

五、激光分子荧光法与色谱分离技术联用

激光荧光分析装置用作高效液相色谱、毛细管电泳的检测器已成为非常活跃的研究领域，并取得许多重要进展。激光诱导荧光检测有许多优点：①灵敏度高；②激光空间分辨率强，能聚焦为很小的光斑，可大大缩小检测池的体积，提高选择性；③激光单色性好，可选择性消除散射光的干扰；④以脉冲激光为光源，采用时间分辨技术可有效消除散射光的干扰，提高方法的选择性。

除常规的激光诱导荧光光谱检测外，荧光窄线光谱和时间分辨荧光光谱的检测也有报道。毛细管区带电泳激光诱导荧光光谱检测的研究尤为活跃。许多荧光效率低的物质可采用衍生技术进行荧光标记进行检测。结合电荷耦合器件检测器（CCD），可实现光谱的快速扫描和二维光谱成像，在毛细管阵列DNA测序中发挥重要作用。半导体激光器的采用将进一步促使毛细管电泳/激光诱导荧光光谱检测向实用化方向发展。目前，毛细管电泳/激光诱导荧光光谱检测在DNA测序、PCR产物分析、氨基酸和许多生化样品的分析上应用非常成功，并具有广阔的发展前景。