第三节　荧光分光光度计

一、仪器结构

常见的荧光分光光度计均由光源、激发单色器、样品室、发射单色器、检测器、显示器等组成。图8-3为单光束荧光分光光度计的光学系统图。

工作原理可简述为：光源光束经入射单色器色散、提取所需要波长单色光照射于样品上，样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于光电倍增管，光电倍增管把荧光强度信号转变为电信号，并经放大器放大后由记录器记录或读出。

1.激发光源

由于荧光物质的荧光强度与激发光的强度呈正比，因此，理想的激发光源应该满足以下条件：足够的强度；在所需光谱范围内有连续光谱；强度与波长无关；光强度稳定。但实际上符合这些要求的光源并不多见，这给荧光物真实激发光谱的测绘带来很大困难。实际通常用的光源有：高压氙弧灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器等。

2.单色器

荧光分光光度计有两个单色器，一个在光源与样品池之间，称激发单色器（第一单色器），其作用是让所选择的激发光通过，照射在被测物质上，而把不需要的光滤去。另一个在样品池和检测器之间，称发射单色器（第二单色器），只让特征波长的荧光通过，照射于检测器上，而把容器的反射光、溶剂的散射光及溶液中杂质所产生的荧光等除去。

3.样品池

荧光测定用的样品池用石英制成（因为玻璃会吸收紫外光）。样品池的形状以散射光较少的方形为宜。低温荧光测定时可在石英池外套上一个盛放液氮的石英真空瓶，用来降低温度。

4.检测器

光电倍增管（photo-multiplier tube，PMT）是目前几乎所有普通荧光分光光度计普遍采用的检测器。PMT是一种很好的电流源，在一定的条件下，其电流量与入射光强度呈正比。

5.显示器

电信号经放大器放大后可由表头指示或数字显示读出荧光强度。通常荧光仪器的显示装置有数字电压表、记录仪和阴极示波器等几种。目前，计算机软硬件技术的发展为人们根据不同的需求选择不同的直观读出方式提供了方便。

二、荧光光谱的校正和荧光仪器的性能

1.荧光光谱的校正

一般荧光分光光度计所测得的谱图均为表观光谱或称为未校正过的光谱，不是真实的。虽然在例行的定量测定中，其光谱是表观光谱还是校正光谱并不重要，但在诸如荧光量子产率的计算时，则要求采用真实光谱。因此要对光谱进行校正。

造成荧光激发光谱和荧光发射光谱失真的原因有：①光源的强度随波长的不同而改变；②单色器对各种波长光线的透射率不一样，单色器的效率受偏振光影响；③每一个检测器（如PMT）对不同波长光的接受敏感度不同，即检测器的感应与波长不成线性等。

由此可见，荧光激发光谱失真主要是由激发光源和激发单色器的光谱特性所造成的。在校正激发光谱时，为了避开检测器的光谱特性影响，多采用光量子计，把不同波长的激发光光量子数转化为成正比例的荧光信号，而后用PMT检测。罗丹明B乙醇溶液是一种常用的光量子计，这种罗丹明B溶液能够提供一个恒定波长的荧光信号和一个正比于激发光光量子的信号，这样一来，PMT所检测到的信号就能正确地反映激发光的光量子数与波长的关系。另外还有光量子计-微机校正法、光量子计-程序电位计法等。

荧光发射光谱的校正方法有：对于荧光分光光度计可采用微机-光量子计法校正和微机-散射光法。对于缺少可自动校正发射光谱的荧光计可以采用标准灯校正法（采用已知光谱输出的标准灯，例如标准钨灯）和标准荧光物质校正法（用标准荧光物质校正发射光谱，对照同一荧光物质的表观发射光谱而获得各波长的校正系数。这些标准荧光物质有硫酸奎宁、β-萘酚、3-氨基酞酰亚胺、m-硝基二甲苯胺等）。微机-散射光法、程序电位器-散射光法这几种光谱校正中，以微机-光量子计法校正激发光谱和微机-散射光法校正发射光谱最为快速和较为可靠。

目前，为了方便分析工作者能够直接记录到校正光谱，配有光谱校正装置的荧光分光光度计已经面市。

2.荧光仪器的性能

荧光仪器的性能一般从以下几个方面考察：①波长准确度与波长重复性：分别将发射单色器和激发单色器波长置零级位置，灯室内正确安好笔型汞灯。将漫反射板校正具放入样品室，使用实际可行的最窄狭缝宽度和快响应时间，慢速度从短波向长波方向对激发单色器和发射单色器扫描。记录仪最大读数时的波长为测量值，连续测量三次，根据测得最大相应值和汞灯的参考波长计算波长准确度与重复性。②分辨率：分别扫描发射单色器和激发单色器，应能分辨出汞三线365.02、365.48和366.33nm所对应的测量峰。③检出限：在荧光仪器中通常用适当浓度的硫酸奎宁标准溶液作样品，灵敏度最高档，选择适当的狭缝宽度。将激发波长置于360nm，扫描发射波长找出测量峰值对应的λ_em。将发射波长固定在λ_em，分别对空白溶液和标准样品溶液连续交替十一次测定，计算标准偏差。用三倍的标准偏差乘以线性斜率表示该仪器的检出限。另外，还有线性误差、基线漂移、光谱峰值强度的重复性和荧光池的成套性等。

（李珊）