第一节　基本原理

一、分子的激发与去活化

在室温条件下，大多数分子处于电子基态的最低振动能级。受光照射时，物质分子将吸收一定波长的光能从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态以至更高电子激发态的不同振动能级，成为激发态分子。

激发态分子不稳定，可以通过辐射跃迁或无辐射跃迁释放出能量返回基态，这一过程称为去活化过程（de-excitation processes）。分子吸收光能被激发和激发态分子去活化过程如图8-1所示。

辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，产生荧光或磷光现象；非辐射跃迁的去活化过程，其结果是电子激发能转化为振动能或转动能，包括振动弛豫、内部转换和体系间跨越。荧光发射（F）：当分子处于第一电子激发态的最低振动能级时仍不稳定，很快（10-7～10-9s）以发光的形式释放能量，回到基态各振动能级。由于振动弛豫使激发态分子在发射前失去部分能量，因此辐射出的光子能量比吸收的光子能量要低。

二、激发光谱和荧光光谱

所有荧光化合物，都有两种特征光谱，即荧光激发光谱与荧光发射光谱。

1.荧光激发光谱

荧光激发光谱（excitation spectrum）简称激发光谱，是通过测量荧光物质的荧光强度随激发光波长变化而获得的光谱。获得激发光谱的方法是：固定荧光波长，改变激发光波长，测定不同波长的激发光激发荧光物质所得到的荧光强度，然后以激发光波长为横坐标，荧光强度F为纵坐标作图，即为该荧光物质的激发光谱。（如图8-2虚线部分）。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系。

2.荧光发射光谱

荧光发射光谱（fluorescence spectrum）简称荧光光谱。获得荧光光谱的方法是：使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度F为纵坐标作图，即为荧光光谱。（如图8-2实线部分）。此光谱上荧光强度最大的波长称为最大荧光波长。发射光谱反映了在某一固定的激发波长下所测量的荧光的波长分布。

3.荧光光谱的特征

①荧光波长较激发光波长较长。在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光波长总是大于激发光的波长。斯托克斯在1852年首次观察到这种波长移动的现象，因而也称为斯托克斯位移。②荧光光谱的形状与激发光波长无关。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光分子被激发至哪一个电子激发态无关；因此，荧光光谱的形状通常与激发光波长无关。③激发光谱与荧光光谱呈现镜像对称关系。

三、主要荧光参数

1.荧光分子的平均寿命

荧光分子的寿命（life of fluorescence molecule）是指停止激发后，荧光强度衰减到最大吸收的1/e所需要的时间，常用τ表示。

荧光强度的衰减通常可用下列方程式表示：

式中，F₀、F_t分别为开始时以及t时间时的荧光强度，以lnF_t对t作图，可得一条直线，由此直线的斜率可以求得荧光寿命的数值。

依据荧光物质所发射荧光的寿命不同，可以进行混合荧光物质分析。

2.荧光发射的量子产率

荧光物质的荧光量子产率（fluorescence quantum yield）或称荧光效率（fluorescence efficiency），用Φ表示。Φ是一个物质荧光特征的重要参数，它反映了荧光物质发射荧光的能力。Φ定义如下：

可见Φ最大为1，但事实上大部分荧光物质的Φ值均小于1。有分析应用价值的荧光化合物，Φ值一般为0.1～1。也就是说，并不是能吸收光能的物质都可以发射出荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除发射荧光外，有无辐射跃迁过程与之竞争。因此，荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关，即：

式中，k_F为荧光发射过程的速率常数；∑k_i为无辐射跃迁过程的速率常数总和。k_F主要取决于分子的化学结构，而∑k_i与荧光物质分子所处的化学环境有关，∑k_i降低有利于体系荧光的增强。

四、荧光强度与溶液浓度的关系

分子荧光分析法是测定物质吸收一定光能被激发之后，物质本身所发射的荧光强度（F）。因此，被测物溶液的荧光强度与该溶液吸收光能的强度及溶液中荧光物质的荧光效率有关。

假设强度为I₀的入射光，照射到浓度为c，液层厚度为b的荧光物质溶液上，透射光强度为I，被溶液吸收光强度为I₀-I，溶液的荧光效率为Φ，荧光强度为F。根据光吸收定律：

故

由于溶液的荧光强度F与被溶液吸收的光强度及荧光效率呈正比：

将式（8-5）中的指数项展开并整理，当溶液很稀时，即abc＜0.05时，得到下式：

当荧光物质一定，测定条件固定时，上式可进一步简化为：

即：在一定的条件下，对某荧光物质的稀溶液（abc＜0.05），荧光物质发出的荧光强度与该溶液的浓度呈正比。式8-7为分子荧光分析法的定量依据。

五、散射光对荧光分析的影响

当一束平行光投射在液体样品上时，大部分光可透过溶液，而少部分光由于和溶剂分子相碰撞，光子运动方向改变，向不同方向散射，这种光称为散射光。

散射光常常是荧光分析实验操作中灵敏度的一种限制因素，在有些分析中，往往难以分辨甚至干扰分析。散射光主要有四种：容器表面的散射光，丁铎尔（Tyndall）散射、瑞利（Reyleigh）散射和拉曼（Raman）散射。

前三种散射光的波长都与激发光波长相同，所以一般离荧光峰较远，比较容易辨认。如采用荧光分光光度计，只要选用合适的波长，不致引入误差。如采用滤片荧光计，则须选择适宜的滤光片，以降低由于散射而造成的本底值。

拉曼散射是由于溶剂分子吸收了光能，被激发到基态的较高振动能级以后，返回到稍高于或稍低于原来的能级，发出的光称拉曼散射光。其波长比它的激发光波长稍长或稍短，且它的波长随激发光的波长不同而改变。一般来说，拉曼散射要比瑞利散射弱，但是当测定溶液浓度低，而要求仪器灵敏度高时，拉曼峰常常成为测定中的突出矛盾。因为它比瑞利峰更靠近待测物荧光峰，有时甚至发生重叠，不易分辨。特别是使用滤光片荧光计时，拉曼散射常常成为荧光空白的一部分，使得荧光本底值过高，从而降低测定的灵敏度和准确度。

拉曼散射光波长比激发光波长更长，对荧光的测定干扰更大，必须采取措施消除。由于拉曼散射光波长与激发光波长有差值，并且随激发光波长改变而改变，而荧光物质发射的荧光波长与激发光波长无关。如改用波长较短的激发光进行激发，荧光物质的荧光峰并不发生改变，而溶剂的拉曼峰将向短波方向改变。这样即可通过选择适当的激发光波长把物质的荧光与溶剂拉曼散射光区别开来。若使用荧光分光光度计，则可减小狭缝或采用截止滤片等以除去拉曼散射的影响。有时溶剂的拉曼光谱与物质的荧光光谱相重叠影响荧光测量，故激发光的选择一方面要考虑较高的灵敏度，另一方面要使溶剂的拉曼散射光与荧光峰相距远些，以避免干扰。

表8-1为水、乙醇、环己烷等常用溶剂在不同波长激发光照射下拉曼光的波长。可供选择激发光波长或溶剂时参考。

（李珊）