第一节 紫外-可见分光光度法基本原理
一、紫外-可见吸收光谱的形成
（一）分子对电磁辐射的选择性吸收
光是一种电磁辐射（electromagnetic radiation），是一种以巨大速度通过空间传播的光量子流。光具有微观粒子的波动性和粒子性，即波粒二象性。
当辐射通过固体、液体或气体等透明介质分子时，电磁辐射的交变电场导致分子的外层电子相对原子核的振荡，致使这些分子发生周期性的极化。若入射的电磁辐射能量（E）正好与分子基态与激发态之间的能量差（ΔE）相等，分子就会选择性吸收该辐射能由基态跃迁至激发态，产生吸收光谱。
式中，E1为分子基态的能量；E2为分子激发态的能量；h为Plank常数6.626×10-34J·s；ν为频率；c为光速2.998×108m/s。
测定某一溶液对不同波长单色光的吸收程度（用吸光度表示），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘图，所描绘的图形称为吸收光谱（absorption spectrum），又称为吸收曲线（absorption curve）。如图7-1所示，吸收程度最大处所对应的波长称为最大吸收波长（maximum absorption wavelength，λmax）。吸收光谱的特征（形状和λmax）是定性分析的依据之一；在定量分析中，则通过吸收光谱选择适宜的测定波长，一般选用λmax，以获得最佳的测定灵敏度和准确度。
图7-1 吸收光谱示意图
1.吸收峰；2.谷；3.肩峰；4.末端吸收。
（二）紫外-可见吸收光谱的主要跃迁类型
1.有机化合物的电子跃迁类型
许多有机化合物吸收紫外-可见光辐射后发生电子能级跃迁，产生吸收带。当有机化合物吸收了紫外或可见光后，分子单键中的σ电子、双键中的π电子和O、N、X或S等杂原子上未成键的孤对电子即n电子都有可能跃迁到能级较高的σ*或π*轨道上。
有机化合物分子中电子跃迁通常有以下四种类型：①σ→σ*跃迁：实现σ→σ*跃迁所需的能量最大，所吸收的辐射波长一般小于150nm，位于远紫外区。超出一般紫外分光光度计的检测范围，因此，一般不讨论由σ→σ*跃迁所引起的吸收谱带。②n→σ*跃迁：含有非成键n电子的杂原子（如—OH、—NH2、—X等基团）的饱和烃衍生物则发生这种跃迁。实现n→σ*跃迁所需的能量比σ→σ*跃迁小，最大吸收波长一般在稍低于200nm的区域内。由于n→σ*跃迁产生的吸收峰多为弱吸收峰，在紫外区仍不易观察到这类跃迁。③π→π*跃迁：孤立的π→π*跃迁的最大吸收波长一般在200nm附近，π→π*跃迁的能量随着π-π共轭程度的增大而减少，吸收峰向长波方向移动（红移）。共轭双键中π→π*跃迁所产生的吸收带称为K带，其主要特点是摩尔吸光系数值一般大于104，属于强吸收。④n→π*跃迁：实现n→π*跃迁所需的能量最小，因此，其最大吸收波长一般在近紫外区。含有杂原子的不饱和键化合物（含＞C==O，—C≡N等）都会发生这类跃迁。由n→π*跃迁产生的吸收带称为R带，其主要特点是吸收弱，摩尔吸光系数值一般小于100。
在上述四类跃迁中，π→π*、n→π*跃迁所需能量在紫外或可见光区，吸收的波长可用紫外-可见分光光度计测定。π→π*跃迁与n→π*跃迁有两个显著差别：①摩尔吸光系数不同。π→π*跃迁的摩尔吸光系数很大，单个不饱和键的摩尔吸光系数在104左右；而n→π*跃迁的摩尔吸光系数很小，一般在10～100范围内。②溶剂的极性对这两种跃迁吸收峰波长的影响不同。当溶剂的极性增加时，π→π*跃迁所产生的吸收峰向长波长移动，称长移（红移）；而n→π*跃迁所产生的吸收峰随溶剂的极性增加则向短波长移动，称短移（蓝移或紫移）。在π→π*跃迁的情况下，激发态π*的极性比基态π强，极性溶剂使激发态π*的能量比π的能量降低更多，π→π*跃迁较容易，因而使吸收峰红移。而在n→π*跃迁中，非成键n电子在基态时与极性溶剂容易形成稳定的氢键，引起n轨道能量降低，使跃迁时所需能量增加则变得不易发生，从而使吸收峰蓝移。这种溶剂效应提示，在有机化合物的紫外吸收光谱测定中，应根据具体情况选择适当的溶剂。
2.无机化合物中主要的电子跃迁类型
与某些有机物相似，无机化合物可在电磁辐射的照射下，产生无机化合物的电子光谱，其电子跃迁形式一般分为两大类。
（1）配位场跃迁：
按照晶体场理论，某些过渡金属或镧系和锕系元素形成的配合物，在配体的配位场作用下，镧系和锕系元素能量相等的f轨道或过渡金属元素能量相等的d轨道分裂成能量不等的f轨道或d轨道，在光能激发下，低能态f电子或d电子跃迁到高能态的f轨道或d轨道上的跃迁，产生配位场吸收带。此类跃迁吸收峰波长受配位体的影响比较大，摩尔吸光系数一般小于100。
（2）电荷迁移跃迁：
指金属配合物中电子从配位体（电子给予体）的轨道跃迁到中心离子（电子接受体）轨道上的跃迁，产生电荷迁移吸收带。此类跃迁的摩尔吸光系数一般大于104，测定灵敏度高，常利用电荷迁移跃迁产生的吸收测定金属离子的含量。
二、光吸收定律
Lambert研究得出：溶液对光的吸光度与液层厚度b呈正比，称为Lambert定律。Beer研究得出：溶液对光的吸光度与溶液浓度c呈正比，称为Beer定律。若综合考虑吸光度与液层厚度b和溶液浓度c的关系，即将两定律合并便得到Lambert-Beer定律：当一束平行的单色光照射到吸光物质的溶液中，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积呈正比。其数学公式表述为
Lambert-Beer定律是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据。
式（7-2）中的比例系数K值，与吸光物质的性质、入射光波长及溶剂等因素有关。当浓度c用mol/L，液层厚度b用cm为单位时，K用符号ε表示，称为摩尔吸光系数，其单位为L/（mol·cm）。ε是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性参数之一。在定量分析中，可用ε值评价方法的灵敏度，ε值愈大，表示测定的灵敏度愈高。当c以g/L，b以cm为单位时，K用a表示，称为吸光系数，单位为L/（g·cm）。
三、偏离Lambert-Beer定律的因素
（一）Lambert-Beer定律成立的条件
Lambert-Beer定律在入射光为平行的单色光、溶液均匀、吸光粒子（分子或粒子）的行为互不影响的条件下才严格成立。实际上有些条件难以达到，如不能获得单一波长的光，溶液中粒子的电荷分布相互影响，将改变粒子的吸光能力。因此，Lambert-Beer定律在应用时有一定的局限性。
（二）影响Lambert-Beer定律成立的因素
1.非单色光
光吸收定律只有在入射光为单色光的情况下才能成立。但分光光度计的光源经单色器分光时，由于单色器分辨率的限制及仪器的狭缝必须保持一定的宽度才能得到足够的光强度，因此，由单色器获得的光并不是严格意义上的单色光，而是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以λ0（中心吸收波长）为中心的一种狭窄波长范围的复合光。对于带宽为Δλ的单色光，测得的吸光度一般小于λ0处的真实吸光度值，产生负偏离。
光谱带宽间接表示分光光度计的狭缝宽度，其定义式为
式（7-3）中，SBW为光谱带宽，单位为mm，
为单色器的线色散率的倒数，单位为
，即dλ以nm为单位，dL以mm为单位，b为狭缝宽度，代表分光光度计的机械狭缝宽度（通常仪器厂商不直接给出，具有一定的保密性），单位为mm。
单色器的线色散率
的定义式为
式（7-4）中，
为单色器的线色散率，f为单色器物镜的焦距，m为光谱级数，d为光栅常数，q为衍射角。
为了减小非单色光的影响，应选用较纯的单色光（即尽可能窄波长范围的复合光）；同时选择吸收曲线上λmax作为测定波长，以提高灵敏度，减小对Lambert-Beer定理的偏离。
2.杂散光
从单色器得到的光，有些与所需单色光的波长相隔较远而不在谱带宽度范围内，这种光称为杂散光。杂散光是紫外可见分光光度计的主要分析误差来源。杂散光主要是由光栅、外光路及单色器内壁散射等原因产生。仪器的绝大部分杂散光来自光栅，其使分析测试的吸光度变小，特别在高浓度时，杂散光的影响更为严重，导致偏离Lambert-Beer定律。另外，由于物质在某些介质中分散为许多微小的粒子，这些粒子会对入射光产生散射。粒子浓度越大，散射越严重，使透射光强度降低，吸光度增大，偏离Lambert-Beer定律。
3.溶液浓度
当溶液处于高浓度时，吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，它们之间的电荷分布将互相影响，从而改变了对光的吸收能力，使吸光度与浓度之间的线性关系发生改变。
4.体系均匀性
当待测溶液为胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除了一部分光被待测物质吸收之外，还会有少部分光因折射、散射或反射而改变方向被损失掉，从而使透过光的强度减弱，实测的吸光度增加；当悬浊液发生沉淀时，又会使透过光强度增加，吸光度减少。这些情况都会导致偏离Lambert-Beer定律。
5.化学因素
溶液中的化学反应，如吸光物质发生离解、缔合、互变异构、配位或配合物组成变化等，都可改变其浓度，从而导致偏离Lambert-Beer定律。