第七节 免疫亲和固相萃取技术
一、技术原理
凡能够刺激机体产生抗体，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。物质刺激机体产生抗体的特异性叫做免疫原性，与相应抗体发生免疫亲和反应的特性称为反应原性。大分子物质（如蛋白、多糖）既有免疫原性又有反应原性，可以直接用于免疫动物制备抗体，这种物质又称完全抗原。而相对分子量小于1000的化合物一般不具有免疫原性，可以通过化学反应将小分子化合物结合到载体蛋白上，使之获得免疫原性。
免疫亲和固相萃取（immunoaffinity solid phase extraction，IASPE）是利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性及可逆性的特性建立的一种固相萃取法。将检测化合物的特异性抗体固定到适当的固相基体上，制成免疫亲和萃取固定相。被测化合物具有反应原性，与抗体特异性地结合在固定相上。淋洗去除杂质，再选用合适的洗脱液将结合在抗体上的目标化合物洗脱下来，从而使被测物质被选择性的提取与浓缩。所得提取物可直接采用气相色谱、液相色谱等方法进行检测。
二、实验技术
（一）人工抗原的制备
卫生化学分析中，待测物质（如真菌毒素、农药和兽药残留等）多为小分子物质，本身无免疫原性，不能直接用于刺激动物产生抗体，需要采用适当的方法将其偶联到载体分子（如蛋白质）上制成人工抗原，用于免疫动物，才能诱导产生抗体。
1.制备方法
小分子物质人工抗原的制备是根据其分子结构采用适当的化学反应来实现的。一般要求所制成的人工抗原稳定性好，有一定的待测物质残基，且残基暴露充分，这样不易被基体破坏和排除，可在体内存留较长时间，足以刺激机体的免疫系统产生免疫应答，从而得到高效价和高特异性的抗血清。根据小分子物质及其衍生物分子中的反应基团，选用适当的方法与载体蛋白质偶联。
（1）带羧基半抗原与载体蛋白质的偶联方法：
对于分子中有羧基的半抗原，可利用其羧基与蛋白质分子上的氨基反应形成肽键发生偶联制成人工抗原。偶联方法有：水溶性碳化二亚胺法：半抗原分子中的羧基在水溶性碳化二亚胺存在下与氨基作用形成肽键而偶合到蛋白质分子上。偶合反应式为：
表示带羧基的半抗原，
表示水溶性碳化二亚胺（EPDC），
表示载体蛋白质。
常用的水溶性碳化二亚胺有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EPDC·HCl）和1-环己基-3-（2-马啉基乙基）碳化二亚胺-N-甲基对甲基苯磺酸盐（Morpho CDI）等。
制备抗原时，一般是将半抗原溶于水或少量乙醇、二甲基甲酰胺、二氧六环等有机溶剂中，再与蛋白质水溶液混合，加入水溶性碳化二亚胺（EPDC·HCl），室温下搅拌反应数小时。在反应期间补加几次EPDC，以保证EPDC的有效浓度。亦可先让半抗原与EPDC反应一定时间，再加到蛋白质溶液中反应数小时。
该法操作简便，反应条件温和，在真菌毒素和农药等物质的人工抗原制备中应用较多。但该法需要使用大量的EPDC，会引起蛋白质分子间的相互交联而出现沉淀，影响抗原的产量和质量。
混合酸酐法：半抗原分子中的羧基与氯甲酸异丁酯在无水溶剂和有机碱存在下反应生成混合酸酐，再滴加到蛋白质溶液中，与游离氨基作用形成偶联物。该法通过生成混合酸酐提高了羧基的反应活性，偶联效率高，蛋白质分子胶联减少。反应式为：
表示带羧基的半抗原，
为氯代甲酸异丁酯。
活性酯法：在碳化二亚胺存在下，半抗原分子的羧基与N-羟基丁二酰亚胺作用生成活性酯，再与蛋白质分子中的游离氨基作用形成偶合物。反应方程式为：
表示带羧基的半抗原，EDPC表示水溶性碳化二亚胺，
表示载体蛋白质。
通过将半抗原制成活性酯，使其分子中羧基的反应活性增加，更易与蛋白质分子中的氨基反应生成偶联物，这可显著提高半抗原的利用率和人工抗原的质量，减少蛋白质分子间的胶联，并可较好地控制偶联物分子上半抗原的残基数目。
（2）带苯胺基半抗原与蛋白质的偶联：
先将半抗原与亚硝酸反应生成重氮盐，然后滴入pH为7～9的蛋白质溶液中，生成偶氮化合物。反应式如下：
表示半抗原，
表示载体蛋白质。
使用重氮化偶合反应，半抗原通过重氮键连接到蛋白质分子中酪氨酸和组氨酸残基上，由于分子间形成共轭π键，结合物通常呈黄色或棕色，根据反应前后蛋白质颜色的变化可以判断半抗原是否结合到载体蛋白质上。这类方法已较成熟，操作简便，偶联效率亦较高。
（3）带其他基团半抗原与载体蛋白质的偶联方法
还原烷基化法：对于分子上有醛基的半抗原，可先让醛基与蛋白质分子的氨基形成Schiffs碱，再用硼氢化钠还原而形成稳定的共价键。
戊二醛法：利用双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原的氨基和蛋白质的氨基形成Schiffs碱而将半抗原偶联到蛋白质上。
2.人工抗原制备的注意事项
①在制备抗原时，制备免疫抗原和测定用包被抗原所用的载体必须来自不同的种源，而且种源差别越远越好。②卫生化学分析中的待测物质（如真菌毒素或残留农药）常具有较强的毒性，因此，制备好人工抗原后，应经过透析或凝胶过滤等方法将人工抗原纯化，除去未与蛋白质偶联的半抗原或偶合反应中生成的其他小分子物质，以免制备抗体时对动物产生毒害作用。
（二）抗体的制备
将半抗原偶联到蛋白质上制成人工抗原后，可采用一定的方法免疫动物制备抗体。
1.多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备方法简便，技术要求不高，费用低，是真菌毒素和残留农药免疫分析中最常用的抗体制备方法。
免疫方法：常用的实验动物有家兔、羊、马、猪、豚鼠等，可根据抗血清的需要量选择免疫动物。下面介绍家兔免疫方法：①首次免疫：采用Fraund’s完全佐剂配制抗原乳浊液，按0.5～2.0mg抗原/只的剂量在家兔的背部作皮内或皮下多点注射；②加强免疫：一般在首次免疫后2～4周对动物进行加强免疫。加强免疫时，用Fraund’s不完全佐剂配制抗原乳浊液，按相同剂量在家兔背部作多点注射，或于四肢作肌内注射，并于加强免疫后1周取耳血测定抗体效价。必要时，可在2～4周后再进行加强免疫，一般免疫3次以上即可获得较高抗体效价的抗血清。在最后一次加强免疫后1周采血，分离血清。
2.单克隆抗体的制备
单克隆抗体是一簇亲和力和特异性完全相同的抗体。单克隆抗体的制备是通过淋巴细胞杂交瘤技术来完成的。这种技术的基本原理是致敏小鼠的脾（B细胞）能分泌特异性抗体，但在一般培养基中不能生长繁殖，5～7天内死亡；小鼠骨髓瘤细胞则具有在体外培养基中不断繁殖的能力，但不能分泌特异性抗体。如利用聚乙二醇作细胞融合剂，将这两种细胞融合成为杂交瘤细胞，该细胞一方面具有骨髓瘤细胞在体外迅速生长繁殖的能力，另一方面又继承了B细胞产生某种特异性抗体的遗传信息，在正常情况下它既能大量繁殖，又能分泌特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备方法如下：①免疫动物，可采用腹膜内注射、皮下注射或采用脾内直接注射人工抗原3次以上，以致敏实验动物BALB/c小鼠。②建立杂交瘤细胞株：取致敏小鼠脾细胞，按1∶5～1∶10的比例与处于对数生长期的骨髓瘤细胞用聚乙二醇进行融合，经选择培养（只让杂交瘤细胞在选择培养基中存活并繁殖下去）、筛选（通过抗体检测，选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞）和克隆化培养（选出能分泌特异性抗体的单个杂交瘤细胞，使之繁殖成为一个细胞株，并淘汰遗传信息不稳定的杂交瘤细胞），建立杂交瘤细胞株。③制备单克隆抗体：将克隆化的杂交瘤细胞扩增培养，注入给予过弗氏不完全佐剂的BALB/c小鼠腹腔，待腹水形成后，收集腹水，分离得到单克隆抗体。
商品化的免疫吸附剂或免疫亲和柱一般采用单克隆抗体。主要是因为单克隆抗体可以在培养液中大量制备，且具有良好的均一性，便于产品质量控制。
（三）抗体的选择
免疫亲和柱所用的抗体与目标化合物的亲和力必须适中，这与其他免疫分析方法不同。免疫亲和萃取或亲和色谱所用的抗体的解离常数通常为10-7～10-8mol/L。如果亲和力太高，需要比较严格的条件才能将目标化合物洗脱下来，容易使蛋白质变性，不利于免疫吸附剂的再生。反之，亲和力太低，萃取能力显著降低，导致溶质的分离能力差，目标化合物流失。
（四）免疫吸附剂的制备
固定抗体的固相载体材料的选择是影响免疫萃取柱性能的重要条件之一。常用的固相载体所用的化学材料主要有琼脂糖、纤维素、聚合物（如乙烯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯衍生物等）、硅藻土、玻璃珠。琼脂糖由于化学稳定性好，非特异性吸附少等优点，在离线免疫萃取柱中使用较多。目前已经有商品化的琼脂糖出售，如常见的CNBr活化sepharose等。但由于琼脂糖机械强度差，高压下易被压缩变形，所以，琼脂糖作为固定载体的免疫亲和柱不能与HPLC等仪器在线联用。另外，琼脂糖载体的生物稳定性差，储存中易降解。
在线免疫萃取常用的固体载体是硅藻土、多孔玻璃。由于硅藻土在碱性条件下不稳定，使用时必须注意pH范围。
将抗体在合适的条件下固定在固相载体上就可以用于免疫吸附。常用的抗体固定方法是直接通过双功能试剂，使抗体分子上的自由氨基、羟基基团与活化的固相载体共价结合。
三、免疫亲和固相萃取柱的性能评价
（一）免疫吸附剂的容量
免疫亲和萃取柱的一个重要指标是免疫吸附剂的容量。单位数量免疫吸附剂固定抗体的总量是免疫吸附剂的容量。虽然免疫吸附剂的容量可以进行理论估算，但在固定化过程中会有一部分抗体的抗原结合部位由于空间取向、静电屏蔽、化学键等因素而失去活性，造成实际吸附容量小于理论值。另外，在亲和萃取中，亲和柱萃取的化合物可能是几种结构相近的化合物，而并非一种。这使得免疫吸附剂的容量计算较为复杂。目前主要有两种计算方法。一种是以一种代表化合物来测量柱容量，这种方法简便，可以用于简单估算；另一种是在一定量其他化合物存在时，分别测定每一种化合物对应的结合容量，这种方法更接近于样品萃取的实际情况。
（二）回收率
造成免疫亲和萃取回收率降低的主要原因是分析物没有与抗体充分结合使得部分分析物直接流出亲和柱。在合适的反应缓冲液中，流速会影响分析物与抗体的充分结合。流速过快，分析物不能完全与抗体结合。上样过程中如果能停留一段时间，回收率就可能会显著提高。
另外，分析物与抗体的亲和性也是影响回收率的原因之一。分析物与抗体的结合力必须适中，亲和力如果太低，目标化合物难以与抗体成分结合；亲和力太高又会造成洗脱困难，二者都会降低回收率。
免疫亲和吸附剂的容量也是影响回收率的重要原因。样品体积一定时，浓度增加，则化合物的结合容量增加。但当样品浓度增加到一定程度，抗体上的抗原结合位点饱和，即达到免疫亲和柱的最大容量，此时，目标化合物结合量不再增加。所以目标化合物的总量应在免疫亲和柱的容量范围以内。在此范围以内，萃取回收率不受样品目标化合物的种类和多少的影响。
（三）交叉反应性
免疫亲和萃取柱特异萃取目标化合物的能力被称为免疫亲和萃取柱的交叉反应性。要注意的是，目标化合物与其结构类似物在免疫萃取柱上的交叉反应性与酶联免疫分析结果不完全相同。多数情况下，化合物在免疫亲和萃取柱上的交叉反应性比在酶联免疫分析中的结果要高。
（四）使用寿命
影响固相萃取柱使用寿命的主要因素是洗脱条件。温和的洗脱条件，如pH为3.0左右的甘胺酸缓冲液可以延长免疫亲和柱的使用寿命；而加入有机溶剂则降低使用寿命。
四、方法应用
免疫亲和固相萃取技术主要用于真菌毒素的测定和农药与兽药残留检测。
1.在真菌毒素分析中的应用
黄曲霉毒素的免疫亲和柱在欧洲已作为一种常用的净化手段用于各种食品、饲料及体液的分析。
欧盟委员会2002/657/EC文件，认证了测定牛奶中黄曲霉素M1的方法，该方法先用免疫亲和色谱对样品进行前处理，再用配荧光检测器的HPLC测定其含量。检测限为0.006μg/kg，定量限为0.066μg/kg，平均回收率为91%，最大相对标准偏差为15%。
2.在农药和兽药残留分析中的应用
Sanchez研制出一种免疫亲和柱，能从水样中选择性提取、纯化除草剂Triclopyr。该柱先固定Triclopyr抗体在衍生后的二氢唑酮基体中，以甲醇∶水为7∶10洗脱，然后与HPLC联用检测。该色谱柱的回收率为80%～110%，色谱柱在使用后可以回收并重复使用至少30次，在液相色谱图的样品峰之间未见任何杂峰，该亲和柱让检测过程变得简单而快速。
韦林洪等采用碳酰二咪唑将Sepharose CL-4B活化并与纯化的抗三唑磷多克隆抗体共价偶联，合成免疫亲和萃取吸附剂并制备对三唑磷具有特异性亲和力的免疫亲和萃取柱。选择0.02mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲液作吸附与平衡介质，60%甲醇水作洗脱剂，该固相萃取柱对三唑磷的动态柱容量达1.91μg/ml床体积，当标样溶液中三唑磷含量为2ng/ml时，柱富集的效率近250倍。采用该柱，在稻米中添加三唑磷0.1μg/ml，洗脱液采用HPLC测定，5次重复测定的平均回收率为102.5%，相对标准偏差4.44%。
在兽药残留检测中对激素类药物和β2-受体激动剂的残留检测中样品前处理使用免疫亲和固相萃取技术应用广泛。β2-受体激动剂是含氮激素中的苯乙胺类药物。免疫亲和固相萃取是β2-受体激动剂检测的关键净化步骤，有时甚至是唯一的净化方法。目前国外已有不少商品的免疫亲和固相萃取色谱柱出售。
3.在生物大分子蛋白检测中的应用
目前有研究显示，通过免疫亲和萃取技术与毛细管电泳或高效液相色谱与质谱联用来测定人或动物体内大分子蛋白的特性。方法具有更好的分辨率和更详细的分解代谢物的鉴定，增加了蛋白质分析的灵敏度和可重复性。
（高蓉）