第三节 固相萃取技术
固相萃取（solid phase extraction，SPE）是从20世纪80年代中期发展起来的一项样品前处理技术，主要基于液-固萃取和液相柱色谱技术相结合发展而来一种快速有效的富集、分离和纯化样品的方法。利用固体吸附剂将待检液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的，具有操作简便、选择性高、易于自动化操作等特点，广泛应用于食品检验、环境监测、医药卫生、化工等领域。
一、固相萃取原理
固相萃取法的基本原理与液相色谱分离机制相似，都是根据待分离组分和样品中其他成分与固定相的作用力（吸附、分配、离子交换等）强弱不同而进行分离，一般情况下，固定相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大，当样品溶液通过预先填充固定相填料的柱子，待分离成分通过吸附、分配、离子交换等形式被保留，用适当的溶剂清洗除去杂质，然后在一定的条件下选用合适的洗脱剂将被测物质洗脱下来，从而达到分离、富集和净化待测物的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。
二、固相萃取的特点
与液-液萃取法相比，固相萃取主要有以下几个优点：①固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中无乳化现象，提高了分离效率；②操作简便快速，简化了样品预处理步骤，缩短了预处理时间；③所需有机溶剂量少，减少了对环境的污染；④采用高效和高选择性的吸附剂，可有效地将待测组分与干扰组分分离，重现性好；⑤易于自动化操作，易于与其他仪器联用，实现自动化在线分析；⑥可同时处理大批量样品。而其缺点是：不适用于处理固体形态的样品，须先将固态样品转化为液态才能进行萃取；对样品的洁净度要求较高，要求样品中不能含有悬浮物或其他固体颗粒，否则会使柱子堵塞，无法进行操作。
三、固相萃取的实验技术
（一）固相萃取的装置
固相萃取装置的基本装置是固相萃取柱或固相萃取盘。
固相萃取柱由柱管、筛板和固定相三部分组成。萃取柱柱管材料多由聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、玻璃或不锈钢等材料制成。筛板位于萃取柱的下方，孔径为20μm，用以支撑固定相，筛板也可用玻璃棉代替。筛板上填充一定量的固定相，然后再加一块筛板，防止加样时破坏柱床。固相萃取柱上端敞开，下端为出液口，液体经过吸附剂后从出液口排出。商品化的固相萃取柱的外观与针筒相似，规格可分为1ml、3ml、6ml、10ml、15ml、20ml、30ml、60ml等，也可根据要求生产特殊规格，使用时根据被测物质与样品基体的性质、检测手段等选择合适的柱型和填料。由于从柱体、筛板和填料都可能向试样中引入杂质，在建立和验证固相萃取柱方法时，必须做空白萃取实验。
固相萃取盘又称膜片式固相萃取，外观与膜过滤器相似，是含有固定相的聚四氟乙烯圆片或载有填料的玻璃纤维片，盘的厚度一般为0.5～1mm，其中固定相的量约占盘重的60%～90%。与萃取柱相比，固相萃取盘的面积增大了，对于同质量的填料，固相萃取盘的截面积比固相萃取柱大10倍。因此，液体试样的流量可加快，从而缩短了样品的前处理时间。同时由于填料紧密地嵌在盘片中，避免了固相萃取柱在萃取过程中液流通过大颗粒的填料时引起的沟流现象，从而使萃取效率提高，增大回收率。
（二）固相萃取的操作步骤
固相萃取主要有以下几个操作步骤：
1.萃取柱的预处理（即固定相活化）
在萃取样品之前，萃取柱必须要用适当的溶剂淋洗进行预处理，一是为了使固相萃取填料活化，以使目标萃取物与固定相表面紧密接触，二是为了除去柱填料中可能存在的杂质，从而提高固相萃取的效率。
2.加样
将液态样品或溶解后的固体样品加入活化后的固相萃取柱，然后利用抽真空、加压或离心的方法使样品进入吸附剂，使样品中待测成分保留在固定相上，而其他组分随溶剂一起流出萃取柱。加样量取决于萃取柱规格、填料量和固定相的类型及待分离组分的性质等。
3.淋洗
选用适当的溶剂冲洗萃取柱，目的是尽可能洗去样品基体中的干扰组分，而将待分离组分留在固定相上。
4.洗脱
选择适当的洗脱溶剂将待分离组分从固定相上洗脱下来，收集洗脱液，挥干溶剂备用也可以直接进行在线分析。为了尽可能地将待分离组分洗脱，而使杂质留在萃取柱上，需要选择强度合适的洗脱溶剂。
（三）固相萃取方式
1.离线固相萃取
离线固相萃取是萃取过程与分析测定过程分别独立进行的方法，仅为以后的分析提供试样。萃取时可通过柱前加压、柱尾减压或抽真空的方法增加溶剂的流速，但溶剂流量不可过高，以免因样品溶液与固定相的接触不充分，影响待分离组分的保留。一般固相萃取柱流量保持在每分钟数毫升，萃取盘截面积大，允许的溶剂流量可适当增加。
2.在线固相萃取
在线固相萃取又称在线净化和富集技术，固相萃取处理样品与分析测定过程在一个系统中，含待测组分的洗脱液直接进入气相色谱仪或高效液相色谱仪进行分析，实现富集、分离和检测过程的自动化，其可靠性、重现性和工作效率等得到了很大程度的提高。
四、固相萃取的理论和方法选择
固相萃取是基于液-固色谱理论，采用选择性保留、选择性洗脱的方式对样品进行分离、纯化、富集。根据固相萃取剂的种类不同，固相萃取法分为正相、反相和离子交换固相萃取。其作用机制主要包括非极性作用（范德华力、色散作用）、极性作用（氢键作用、偶极矩和诱导作用等）、离子作用和共价作用等。
（一）固定相的分类
1.极性固定相
正相固相萃取所用的固定相都是极性的（如氧化铝、硅酸镁、氨基、氰基、双醇基键合硅胶等），吸附剂的极性大于洗脱液的极性，用来萃取极性物质。主要是通过待分离组分的极性官能团与固定相表面的极性官能团发生相互作用，其中包括了氢键、π-π键、偶极-偶极和偶极-诱导偶极相互作用以及其他的极性-极性相互作用，使溶解在非极性溶剂中的极性物质被富集在固定相的表面；洗脱剂要用非极性有机溶剂，如正己烷、四氯化碳等。
2.非极性或弱极性固定相
反相萃取的固定相和目标化合物通常是非极性或极性较弱的，目标物与吸附剂之间的作用是疏水性相互作用，属于范德华力或色散力。如烷烃类化学键合相（键合硅胶C18、C8等），通过待分离组分的碳氢键与固定相表面官能团非极性-非极性相互作用，使得溶剂中的非极性和中等极性的组分保留在固定相表面，使用甲醇、乙醇、乙腈等溶剂洗脱。当样品中杂质的极性比待分离组分的极性强时，一般可采用反相固相萃取。当样品溶液流过萃取柱时，杂质不被保留，随溶剂一起流出，而待分离组分保留在萃取柱上，然后选择合适的洗脱剂，将待分离组分洗下。若杂质的极性比待分离组分极性弱，也可采用此种分离模式，但要进行分步洗脱，即先用极性较强的溶剂将极性组分洗下，再用极性较弱的溶剂除去杂质。
3.离子交换固定相
离子交换固相萃取的固定相为离子交换树脂，用来萃取有机和无机离子型化合物，如氨基酸、核酸、有机碱、离子表面活性剂等。按其活性基团的不同，又分为强酸型阳离子交换树脂和强碱型阴离子交换树脂，作用机制都是待分离组分的带电荷基团与固定相表面的带电基团发生离子静电吸引，从而实现分离。分离组分是离子型化合物，采用高离子强度的缓冲液进行洗脱。
4.吸附剂固定相
吸附固相萃取的固定相为吸附剂，如常用的吸附剂有大孔吸附树脂、石墨碳材料、硅胶、氧化铝等。除使用大孔吸附树脂、石墨碳材料可以萃取非极性物质外，吸附固相萃取主要用于极性化合物的萃取。
此外，还有以葡聚糖凝胶为固定相，根据待测组分大小不同进行分离，小分子或离子自由扩散到凝胶颗粒的空隙中，大分子被排阻，而被优先洗脱。免疫亲和固定相为抗体与惰性基质（如键合硅胶、珠状琼脂糖）的偶联物，利用抗原-抗体之间的特异性、可逆性免疫结合反应的原理，当含有待测组分的样品通过固定相时，固定抗体选择性地结合待测物，其他不被识别的干扰成分则流出，尤其适用于复杂样品中极稀组分的净化与富集。分子印迹聚合物为固定相，利用分子印迹聚合物特异性锁定目标物，再通过洗脱将目标物洗脱下来从而达到富集和检测的目的，分子印迹固相萃取技术的使用可弥补固相萃取选择性盲目的不足，对于复杂样品中的特定成分的富集与分离十分有效。
（二）固定相的选择
待分离组分的最佳保留效果取决于组分的极性与固定相的相近程度，二者极性越接近，则保留效果越好。因此，选择固定相，其极性要尽量与待分离组分的极性相似，与样品溶剂的极性相似。若待分离组分极性适中，则正、反相固相萃取都可使用。
选择固定相还须考虑以下因素：①待分离组分在极性或非极性溶剂中的溶解度；②待分离组分是否能够离子化，可否采用离子交换固相萃取；③能否与固定相形成共价键而影响洗脱；④杂质与待分离组分在固定相上的竞争作用的强弱，对分离效果的影响等。
固定相的用量取决于待分离组分的性质及其在样品中的浓度。增加固定相的用量，通常可以增加待分离组分在柱中的保留，一般可通过绘制固定相作用曲线来确定固定相的用量。
（三）洗脱剂的选择
在固相萃取中，选择洗脱剂时，应考虑以下几个因素：①溶剂强度要足够大，可以保证吸附在固定相上的分析物定量的洗脱下来；②洗脱剂不应对分析物的检测产生干扰；③选择的洗脱剂应与后续的分析相适应。
洗脱剂的选择主要取决于待分离组分和固定相的性质。对于非极性或弱极性固定相如键合硅胶C18，可使用甲醇或乙腈；极性固定相要用非极性有机溶剂，如正己烷、四氯化碳等；离子交换吸附剂要用高离子强度的缓冲液，目的是中和待分离组分官能团上所带的电荷，或者是中和键合硅胶官能团上所带的电荷，破坏其静电作用，使待分离组分洗脱下来。
五、固相萃取技术的应用
（一）在食品分析中的应用
1.食品中农药残留分析
食品种类繁多，基体类型复杂，因此须根据样品性质、待测农药类型，选择固定相和萃取剂。一般可选择采用C18柱、Florisil固相萃取小柱等，以甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷或混合溶剂为提取剂和洗脱剂，提取分离粮食、蔬菜、水果中的有机氯、有机磷等农药和杀虫剂等污染物。
2.食品添加剂分析
食品和饮料中防腐剂、色素、人工合成甜味剂，如对羟基苯甲酸甲酯、柠檬黄、糖精钠等，均可采用固相萃取法进行提取、分离。
（二）在环境分析中的应用
1.环境水体中有机污染物的分析
固相萃取技术可广泛用于水体中有机污染物的痕量富集。苯并［a］芘是多环芳烃中致癌性最强的化合物之一，测定水中苯并［a］芘的关键在于待测物的分离和富集。采用C18富集小柱，以极性较小的二氯甲烷和苯为洗脱剂，回收率为87%～102%。
2.环境水体、土壤中农药残留分析
测定水体中的农药残留可采用C18或C8柱，用甲醇作为洗脱剂，将提取、分离和富集同时完成。土壤中的农药残留，须先采用适当的方式将待测组分提取出来，再利用固相萃取进行分离、富集。此法可用于有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、三嗪类农药、杀虫剂、除草剂的分离、富集。
3.环境空气中痕量有机物分析
环境空气污染中挥发性和半挥发性组分，一般采用固相萃取、溶液吸收和低温冷凝富集采样。在常温或低温下使空气通过小柱，利用分配系数的不同，将待测组分保留在柱上，而空气中正常组分如氮、氧等通过小柱流出，从而达到富集有机化合物的目的。
（三）在药物分析中的应用
固相萃取技术与高效液相色谱、质谱法等分离检测手段联用，可实现样品在线预处理，使其在药物代谢动力学、新药研发和临床诊断，以及药用植物分析等药学领域的应用日益增多。
（宋秀玲）