第二节　类方功效物质基础表征的适宜方法与技术

方剂功效物质基础研究是中医药研究领域关键科学问题之一，是制约中医药现代化的重要瓶颈。针对方剂功效物质研究的复杂性和整体性特点，客观表征方剂及类方的功效物质显得尤为重要。课题组提出以系统论思想与复杂性科学理论为指导，以系统生物学、生物信息学研究方法和手段为支撑，强调运用多学科方法和技术探讨方剂功效物质基础的同时，注重综合分析物质变化-生物效应-配伍规律三者之间的联系，以及方-证-病相关性研究模式，为阐明方剂科学内涵提供参考。因此，方剂功效物质基础研究是研究方剂生物效应、作用机制及配伍规律的前提和基础。

一、方剂功效物质基础研究现状、存在问题与研究方法

1.研究现状回顾

国内外学者针对方剂的效应物质进行了一系列的科学研究，取得了阶段性成果，不少学者提出了有意义的思路和观点。如周俊提出中药复方天然组合化学库与多靶作用机制；薛燕等提出的中药复方多成分经多途径协同作用的霰弹理论；余亚刚提出中药复方化学成分系统分离与鉴定的三元设计方案；曹治权等提出的中药配位化学理论以及黄熙等提出复方药动学和证治药动学及方剂组织药理学假说；段金廒等就方剂现代研究的一些共性问题提出方剂效应物质基础研究必须在充分尊重和理解中医方剂理论和临床实践指导下，有效促进中医与中药、传统与现代、基础与应用的融会贯通；必须采用现代生物学、生理、病理、药理等现代技术和方法揭示方剂治病疗疾的物质基础；同时较为系统地介绍了方剂配伍规律及生物效应研究、方剂活性物质基础研究、新技术在方剂中的应用、方剂信息资源挖掘与利用等研究框架。陆茵等就方剂物质基础与生物效应研究的一些共性问题，提出应用生物技术领域的若干新技术开展方剂相关研究的一些思路和方法。杜冠华等提出了中药复方有效成分组学概念、研究内容及意义，并介绍了中药复方有效成分组学研究的方法。这些理论的提出与研究工作实践的体会对如何开展方剂复杂效应物质的研究具有一定的启发和理论指导。

目前，方剂效应物质研究主要采用以下几种方法：①通过分析方剂中某个或某些药味的有效成分或指标性成分的变化，以评价方剂的效应物质。袁久荣等测定了四物汤中各药单煎、分煎、合煎液中阿魏酸的含量，表明合煎时各成分间具有增溶效应；严永清等测定了生脉散合煎液中人参皂苷含量低于分煎液，但人参皂苷Rg₃和Rh₁含量明显高于单味人参水煎剂等。②采用天然药物化学的研究方法，将复方视为一个整体，采用现代各种化学方法和色谱技术对方剂化学成分进行提取分离鉴定和活性评价，该方法有助于了解复方的化学物质基础，通过与单味药化学成分的比较，也有可能发现复方配伍后产生的新成分等。王燕生等从四君子汤复方和单味药白术的水煎液中分得苍术醚、苍术内酯、羟基苍术内酯等4种成分，表明四君子汤中白术的主要化学成分没有变化。此外，有学者对小青龙汤、泻心汤类方、四逆汤、白头翁汤、芍药甘草汤、小柴胡汤、六味地黄汤、十全大补汤、二妙散等方剂进行了不同程度的化学研究。③采用色谱联用技术以及智能多柱系统对方剂效应物质谱效相关性进行研究。张子忠等采用反相液相色谱模式，以黄芪、当归以及自制的“当归补血汤”的分离、特征组分识别以及指纹对比的实例分析，介绍了中药配伍分析的多模式多柱色谱系统以及统一分析方法的研究思路。

国外学者尤其是日本学者对汉方研究有着浓厚的兴趣，如田真代一提出中药血清药理学和血清药物化学的研究方法；基于与血清药理学相似的原理，日本学者Homma等提出利用药动学方法筛选中药有效成分；对方剂经服用后进入体内代谢后的化学成分进行研究，如Kano等人采用HPLC-DAD-MS法定性定量分析大鼠服用甘草附子汤后，血中桂皮酸和6E，12E-十四碳二烯-8，10-二炔-1，3二醇，结果表明该两个化合物可能是甘草附子汤的活性成分等。

2.研究现状分析

国内外学者对方剂功效物质基础研究，虽然取得了一些阶段性成果，为进一步深入研究奠定了基础，但同时还存在一些关键问题尚未得到有效解决，主要表现在以下几个方面：

（1）对方剂的研究始终存在着一种还原、线性、静态的思维定势，难以体现方剂系统功能行为的整体性。

（2）当前应用中的生物效应评价模型和方法并不能客观评价多系统作用的耦合关系，即方剂本身的复杂系统与人体复杂系统相互作用，以及方剂与临床的互动关系，从而使研究结果陷入支离破碎，难以真正阐明方剂生物效应的实质以及方-证-病之间的相关性本质。

（3）脱离中医药理论和临床实践的指导，单纯从某一个或几个成分来阐明方剂效应物质基础及其药理作用，缺乏整体性研究，难以真正阐明方剂效应物质群及其整体综合效应。

（4）对方剂发挥效应的化学物质动态变化及其效应变化，即对方剂配伍-生物效应-药物代谢相关性研究相对不足。

3.系统论思想、复杂性科学及系统生物学、生物信息学的建立与发展为方剂功效物质基础研究提供了新的研究方法和手段

（1）方剂功效物质的复杂性：

复杂系统是信息科学与系统理论近年来的一个重要发展方向，以还原论、经验论及“纯科学”为基础的经典科学正逐步吸收系统论、理性论与人文精神，进而促使了复杂性研究的兴起。中医方剂作为由中药遵循君、臣、佐、使配伍规律组成的、具有一定结构和整合调节作用的整体，是一个充满非线性关系的复杂系统。除具有一般系统论的基本特征外（即整体性、联系性、有序性、动态性和自组织性），组成方剂的中药既是在传统中医药理论指导下的遣方用药体系，又是一个复杂的化学体系，当方剂与开放的人体复杂系统相互作用时，其非线性特点更增加了方剂功效物质的复杂程度。因此，方剂功效物质决非单味药化学成分的简单加和，而是方剂中全部功效成分群的有机综合。

可见，方剂功效物质的多样性、差异性及其自组织性、整体涌现性等特征，以及方剂内部组成部分间的相互关系、相互作用，方剂与人体之间的动态非线性相互关系和相互作用决定了方剂效应物质是一个复杂系统。因此，方剂功效物质基础的揭示必然基于方剂功效物质组学的理念和方法技术。

（2）以系统论思想为指导，把握方剂功效物质的研究规律：

鉴于方剂功效物质是一个复杂化学系统，其研究思路和方法也应当“把复杂性当作复杂性来处理”。方剂功效物质组是指由引起方剂特定功效的有效物质构成的系统，是方剂发挥作用的物质基础。而方剂功效是对方剂功效物质系统与人体系统相互作用的概况和总结，方剂功效物质不仅包括某些单味药的原型成分，亦包括方剂在加工如煎煮、炮制过程中以及人体内环境条件下形成的有效物质，如人胃肠道及组织器官中的代谢产物等。因此，阐明方剂功效物质应着重从以下几方面开展研究：

1）以整体观念为指导原则：

将方剂整体作为研究对象，利用现代科学理论、方法和技术从不同层次、不同角度进行多元化研究，逐步地、全面地从各环节揭示方剂的作用本质。

2）重视方剂功效物质系统中各组成部分之间的相互作用研究：

通过从组成方剂的功效物质之间非线性相互作用入手，阐明方剂功效物质组成、变化及其与生物效应之间的相关性，阐明方剂复杂功效物质及其相应效应。

3）重视方剂功效物质组成的动态变化与生物效应变化的相关性：

通过对方剂发挥功效的化学物质的动态变化、生物效应变化以及药物代谢等相关研究，揭示方剂作用物质、作用过程及作用机制。

4）充分利用现代生物信息学方法和技术进行系统分析研究：

针对方剂功效物质组成研究的各组相关数据进行分析、归纳，挖掘复杂功效成分群之间、物质与生物效应之间、功效物质与人体作用过程之间的相关规律，从不同层面揭示方剂复杂功效物质。

（3）以复杂性科学为理论支撑，构建方剂功效物质基础的研究模式：

复杂性科学不仅表明了客观事物所具备的自身特有的规定性，而且引起了思维方式的变革，为研究复杂系统提供新的途径和方法。方剂功效物质既具有自身组成结构、内部结构和功能行为的复杂性，又表现出其与人体相互作用时物质-效应变化的复杂性。因此，欲阐明方剂复杂功效物质必须在复杂性科学理论指导下进行研究。

依据中医临床遣方用药方-证对应的原则及复杂系统的特点，目前方剂效应物质的研究应针对方剂功效物质的适应证明确化与生物效应科学评价等方面，才可能有所突破，为创制新型中药新药奠定基础。由于中医临床用药遵循“有是证，用是方”的基本原则，方剂效应物质也应有其相应明确的适应证，从而使方证更加明确、临床疗效更加显著，同时阐明同一方剂对于“不同证不同病”“同证不同病”治疗的深刻内涵。不少研究已证明通过方剂加减，可使方证更加明确，临床疗效提高，如治疗不同证型原发性痛经的有效经典方剂，即是在基本方四物汤基础上进行加减化裁形成系列类方。在精制方血府逐瘀胶囊与原方血府逐瘀胶囊治疗冠心病心绞痛的研究中发现，精制方优于原方，但在治疗其他血瘀证方面的疗效可能不如原方。当归芍药散精简方（茯苓∶白术∶当归=10∶5∶3）治疗血管性痴呆疗效优于原方当归芍药散。

（4）以系统生物学研究方法为技术支撑，探求方剂复杂功效物质的科学内涵

1）中医方剂临床证候的生物效应评价体系：

一个临床有效方剂是针对某一适应证而设，因此首先要建立起规范化的证型分类及判定标准，才能真正体现中医辨证施治及其临床疗效的精髓。

在辨证分型规范化的基础上，应用代谢组学、蛋白组学以及基因组学等现代系统生物学理论与技术，对中医证候的本质进行研究，建立证候的信息数据库，从中选择能够反映疾病本质的指标体系以评价方剂的临床疗效，基本明确病理状态下人体的变化即证的本质，从而阐明方剂的内在配伍规律及作用机制，实现方-证-病的相关性研究。

2）方剂生物模型的效应评价体系：

通过对临床中医证候本质的研究及数据挖掘分析，确定反映疾病本质的系列指标群，采用模式生物进行模拟，建立实验室生物效应评价体系。分别从整体动物模型、组织器官模型、细胞亚细胞模型及分子水平四个药理水平建立生物效应评价体系，并结合方剂体内直接作用物质及作用机制探讨，通过对方剂复杂化学物质干预后系列指标的变化，运用计算机分析技术进行分析、统计、归纳，以探讨方剂配伍规律及作用机制，实现物质-效应相关性研究。临床疗效评价与生物模型效应评价的有机结合及相互验证是阐明方剂复杂效应物质-生物效应-作用机制的关键所在，能否建立起符合“证”本质特征的生物模型，直接关系到方剂生物效应的评价及方剂复杂效应物质的阐明。

3）物质基础-生物效应-配伍规律的系统研究：

传统中药复方长期临床应用大多以其汤剂发挥药物的整体综合效应，为了阐明其产生效应的复杂物质基础可将其分解为不同部分，针对不同部分的生物效应及其物质组成进行分析评价，在基本明确各部分有效组分群及相应效应的基础上，通过验证有效组分群与方剂的整体综合效应，或不同有效组分群针对不同“证”的效应指标改变，以系统评价方剂复杂效应物质，进而揭示方剂不同配伍针对同“证”不同病或同病不同“证”的科学内涵。

在基本明确方剂复杂功效物质群化学组成的基础上，对各主要功效组分群的配伍配比及相应生物效应的相关性进行深入探讨，从物质基础、生物效应层面上揭示方剂的内在配伍规律，使方剂配伍规律的研究从药材饮片层面提升到功效组分群及生物效应层面，为创制适应证明确、物质基础清楚、作用机制明确的现代新型中药奠定基础（图3-4）。

（5）运用生物信息学手段分析方-证-病间的相关性，以揭示功效物质-中医辨证-临床疗效间的内在规律：

当前，随着生命科学、信息科学、计算机科学、数学、物理学、医学、化学、生物学等学科的发展，交叉孕育出一门新的学科，即生物信息学（bioinformatics）。生物信息学是在生命科学研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索、分析、处理和综合利用的科学，可以透过海量数据洞察隐藏在数据中的规律。因此，在中医方剂、证候等特色内涵与规律挖掘方面的应用，将对分析方-证-病间的相关性以及揭示物质基础-生物效应-配伍规律间的相关规律起到推动作用。

方剂研究是一个复杂的系统，其研究必须在中医药理论以及系统论、复杂性科学、系统生物学等现代前沿学科研究思路和方法的指导下，以方剂的临床疗效为基础，以方剂的生物模型研究为深化，充分体现中医药特色，运用现代先进的科学技术与手段及生物信息学方法，揭示方剂复杂功效物质群与配伍规律及方-证-病的相关性及其规律。在强调运用多学科方法和技术探讨方剂功效物质的同时，注重综合分析物质变化-生物效应-配伍规律三者之间的联系，以阐明其作用机制。因此，方剂功效物质组的研究是研究方剂生物效应、作用机制及配伍规律的前提和基础。

通过临床疗效评价体系及生物模型效应评价体系的建立，使方剂效应评价更加客观化、标准化，使方剂效应物质、配伍规律及作用机制研究更接近于客观事实，为创制新型药物及有效回归临床奠定基础，从而推进中医药现代化进程；通过生物信息学的方法和技术，寻求方-证-病间的相关性，以揭示效应物质-生物效应-配伍规律间的相关规律。

二、方剂类方功效物质基础研究方法与技术体系

（一）类方功效物质的分离分析方法与技术

1.方剂功效物质/成分群的分离纯化、分析检测技术

方剂功效物质基础（功效组分、功效成分）复杂多样，包括了多种结构类型的化学成分，如挥发性成分、黄酮类成分、生物碱类成分、有机酸类成分、蒽醌类成分、香豆素类成分、木质素类成分、萜类成分、皂苷类成分、生物大分子物质、无机元素等，甚至一些结构类型的化合物已明确其构效关系，如黄酮类成分等。对于各类功效组分/功效成分群的分离纯化以及分析检测方法和技术，国内外学者进行了大量研究，并取得一定研究积累。

（1）挥发性化学物质分离/检测技术：

挥发性物质主要是由单萜、倍半萜/苯环类等易挥发性小分子组成，具有辛温解表、通窍醒神、祛寒止痛等功效，是中药材及其方剂发挥治疗作用的有效成分之一。

传统汤剂中挥发性成分是以芳香水剂的状态存在，受方剂中水溶性成分的促溶、增溶等作用使其在汤剂中的含量增加。经典的蒸馏法能使挥发油得到有效的收集，目前以SFE技术、分子蒸馏技术为代表的挥发性成分萃取分离技术，克服了诸多不足。对于挥发性物质分析检测常采用气相色谱法、气相色谱-质谱联用技术等方法和手段。

（2）多酚类化学物质分离/检测方法和技术：

酚类成分在自然界中存在广泛，主要涉及小分子酚类、黄酮类成分、蒽醌类成分、香豆素类成分、木脂素类成分等。现代研究表明该类型成分具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等广泛的药理活性。

目前多酚类成分多采用大孔吸附树脂法、聚酰胺色谱法及硅胶柱层析的方法进行分离纯化，方法较为单一。膜分离技术在中药中的应用克服了许多缺点和不足，该方法以传统汤剂为研究对象，对其中某类或某几类活性物质进行浓缩、富集、纯化，能够一定程度上体现出中医药的整体观念，体现中医用药特色。

（3）酸碱性化学物质分离/检测方法技术：

酸碱性化学物质主要包括生物碱类和有机酸类成分。生物碱是一类存在于生物界（主要是植物）中，大多具有显著生物活性的含氮碱性化合物，是中药最主要的一类活性成分；有机酸是具有羧基的化合物（不包括氨基酸），广泛存在于植物体的各部位，尤以果实中为多见。该类化学物质在汤剂中通常以盐的形式存在，使其在水中溶解度增加而增强疗效。

针对酸碱性化学物质的理化性质及可用于分离的特性，通常采用酸碱萃取法、大孔吸附树脂法、离子交换树脂法等进行分离纯化。采用HPLC、HPLC-MS-MS、CE、CE-MS、离子色谱法、气相色谱法、薄层扫描法等方法进行分析检测。超临界流体色谱更适用于中药生物碱类的分离。

（4）生物大分子化学物质分离/检测方法技术：

生物大分子化合物主要包括中药中核酸类、蛋白质（酶）类、多糖类、肽及寡核苷等成分，其分离与纯化早已引起学术界的极大兴趣。色谱技术的广泛应用使药用生物活性大分子、多糖蛋白质、核酸的大规模生产成为可能。目前用于分离生物大分子的方法是高效液相色谱法，其分离介质主要采用大孔径的多孔担体，而忽略了生物大分子的构象、活性等与流动相环境之间的关系。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得生物活性大分子的手段不断得到提高，如超滤技术、分子排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱等。其中超滤技术是通过膜分子筛分级分离中药大分子活性物质最具应用前景的方法，它不影响成分的活性，又能用于产业化生产。

（5）无机元素及其有机分子络合物分离/检测关键技术：

植物中的无机成分多为钾、钠、铵的盐类，它们或与各种有机物质结合存在于细胞中，随着科学的发展和研究的深入，发现不少无机元素具有重要的生理活性与疗效。目前对于中药中无机微量元素多采用原子吸收光谱对其进行定量检测，或采用ICP-AES、ICP-MS以及LC联用技术等方法进行分析。

（6）萜类及皂苷类化学物质的分离/检测关键技术：

该类化学物质是广泛分布于植物界中一类复杂成分，常常具有重要的生物活性。目前多采用大孔吸附树脂法、葡聚糖凝胶色谱法、硅胶层析法进行分离纯化，有些化合物如环烯醚萜类往往在提取、分离纯化过程中结构发生变化。近年来发展起来的逆流色谱技术克服了化合物不可逆吸附以及变性的问题。

2.化学成分的结构鉴定谱学与X射线衍射技术

（1）UV：

电子光谱，是分子中电子能级的跃迁，对于分子中含有共轭双键、不饱和羰基结构及芳香体系的化合物的结构鉴定，是一种重要手段。通过测得的紫外光谱所提供的吸收波长和吸收系数及其变化规律可解决结构研究中的有关问题。

（2）IR：

红外光是电磁波的一种形式，通过红外光谱吸收峰的波数和吸收强度可推测结构中是否存在某些官能团及官能团所处的化学环境，指纹区的吸收与已知物谱图比较，也可得出化合物结构的相关鉴定信息。在鉴别化合物的异同和光学异构体，立体化学研究和官能团的确定中发挥重要作用。

（3）1D/2D NMR：

NMR谱是化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，发生核磁共振，图谱能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式，周围化学环境以及构型、构象的结构信息。1H-NMR记录有机分子中各质子在外加磁场中受照射频率作用所产生的不同的共振频率。通过化学位移，裂分情况及积分曲线高度可判断分子中1H的类型，数目及相邻原子或原子团的情况。13C-NMR：提供分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移，异核偶合常数及弛豫时间。常见的13C-NMR测定技术有DEPT谱及INEPT谱等。2D-NMR可解决1D-NMR中信号过于复杂，堆积难分辨的情况，常用的有1H-1H COSY谱（反映邻碳氢的偶合关系），13C-1H COSY谱［包括HMQC（反映的是直接键连的C-H间的偶合关系），HMBC谱（可高灵敏度检测13C-1H远程偶合）等］，NOESY和ROESY谱（属NOE类的二维核磁共振谱，NOE主要用来确定两个质子在分子立体空间结构中是否距离相近，若存在NOE则表示两者接近，NOE值越大，则两者在空间的距离就越近，NOESY采用二维方式检测NOE，显示1H核之间的NOE相关，ROESY是旋转坐标系中的NOESY）等。

（4）HR-MS：

高分辨质谱可以将相对分子质量精确到0.000 1，可直接得到元素组成及确定的分子式。

（5）X线：

是一种独立的结构分析方法，在样品本身能获得晶型良好的单晶条件下，可以完成天然有机小分子和生物大分子样品的晶体结构测定，定量给出分子立体结构参数。还能完成化合物分子相对构型与绝对构型的测定，特别是在有机化合物分子立体结构中的构型确定、构象分析以及固体化合物样品的晶型与分子排列规律，有机分子的异构体及其含量测定等。

（二）类方功效物质基础发现方法与技术

1.生物膜萃取-色谱联用在线分析技术

包括生物膜提取-化学活性成分在线分析技术、在线色谱分离与活性筛选联用技术、分子印迹聚合物分离技术。根据现代生物学认识，在生物体内药物分子只有通过某些生物膜进入特定的细胞或和特定生物膜上的受体结合形成复合物才能发挥相应的活性。药物分子通过生物膜或和膜上受体结合的过程，可以看作是生物膜选择性的将药物分子提取出来的过程。为了发现具有细胞水平活性的中药活性物质，扩展活性物质的活性覆盖范围，针对特定的细胞、特定自由基的相关活性作用，设计了基于生物膜选择性提取和在线分离-活性评价的技术以实现细胞水平在线功效物质的快速发现。

（1）生物膜提取-化学活性成分在线分析技术：

基于生物膜色谱的活性化学成分在线分析技术是在传统在线生物膜色谱技术上改进而来的，中药活性成分快速筛选辨识技术，它以活性生物膜靶标（如细胞、活性细胞膜、模拟生物膜、活性大分子）为固定相，该固定相能够特异性、选择性地与活性成分结合，排除大量无法和生物膜结合的无活性作用成分干扰，通过高分离效能的高效液相色谱及其联用技术，快速地从中药成分中筛选出活性物质（图3-5）。

该方法将活性物质识别、提取与分离分析技术有机结合起来，简便、快速，是研究中药、方剂等复杂对象活性物质的有效手段。

（2）在线色谱分离与活性筛选联用技术：

利用液相色谱高分离效能的优势，将方剂复杂体系成分进行在线色谱分离，通过与在线活性检测体系联用，对洗脱的化学成分进行活性检测，亦可进一步与质谱或NMR技术联用，分析相关活性成分特征。例如：将HPLC与自由基清除活性反应器（DPPH、ABTS等体系）联用，利用抗氧化剂常有较强的自由基清除活性原理，使中药提取物的化学成分经HPLC洗脱出来即可在线进行自由基清除活性的测定，从而可以直接进行活性化合物的鉴定，该方法简单、快速。亦可以将其与NMR等进行联用，实现样品的分离、抗氧化活性成分筛选和结构确认一次完成，实现中药活性成分的快速筛选。

（3）模拟生物膜（脂质体）平衡透析-高效液相色谱联用技术：

以中药提取物（有机整体）为对象，采用高效液相色谱技术，分离、分析比较中药、复方提取物直接透析和中药提取物与模拟生物膜（脂质体）混合物透析后所含各种物质峰面积的变化，其中峰面积显著减少的峰即是与模拟生物膜（脂质体）有作用的成分，应用在线LC/MS等技术鉴定这些成分，就可从复杂的中药体系中筛选出能与模拟生物膜（脂质体）结合的成分。以当归补血汤及其组分总提取物为对象进行研究，结果显示，当归补血汤直接提取物中有50余个峰，通过HPLC-DAD-ELSD联用检测生物样品，其中15个峰与模拟生物膜具有明显的相互作用，采用LC-MS技术和标准品对照的方式，对15个成分的结构进行了全部鉴定，并初步做了通透性能力评价，鉴定这些成分中包括藁本内酯、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等，与文献报道当归补血汤中的活性成分具有很好的一致性。

2.正向分离-逆向剔除相结合的方剂功效成分群发现技术

方剂功效物质是多成分经多途径的协同作用，有效成分的协同、相加作用表现出临床相关疗效的方药君、臣、佐、使的成分主次关系。方剂功效物质是一个复杂化学体系，这种复杂的化学系统给方剂的深入研究带来了极大的困难和挑战。迄今为止方剂中已经明确其药效的物质基础，已涵盖了中药成分结构分类的各个类型，如挥发性成分、黄酮类、生物碱类、有机酸类、蒽醌类、香豆素类、木质素类、萜类甾类、皂苷类、多糖多肽等大分子物质、无机元素等。

（1）正向分离技术：

在方剂研究时必须考虑方剂功效的生物效应，拆方研究很可能拆去一些协同、拮抗或复合作用，需以全方为整体进行研究，通过功效成分/组分群解析，从全方提取物→提取物、组分→成分的互动过程，从而阐明方剂功效物质基础。

（2）抗体亲和层析特异性剔除技术

单一成分的剔除 合成代表性成分的牛血清白蛋白结合物，用其免疫家兔或小鼠，制备抗该成分的多克隆抗体，必要时，通过免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，制备单克隆抗体，纯化并制作针对该成分的抗体亲和柱，用此亲和柱处理中药样品，用HPLC确认剔除前后特定成分的变化。

多个成分的剔除 制备抗体的程序同上，将中药样品依次通过两个不同成分的亲和层析柱，用HPLC确认剔除前后特定成分的变化。根据前面的研究结果，必要时，制备特异性剔除两个以上不同成分组合的样品。

（3）分子印迹聚合物分离技术：

中药体系是一个复杂的、包括丰富的分子多样性及有效成分的天然组合化学库，其所含的化合物结构类型多样、含量悬殊且许多成分未知，常规的分离材料往往选择性不理想，分离效率低，且容易丢失微量的有效成分，这样就可能错过了发现新的活性成分的机会。因此，如何从复杂的中药体系中分离纯化有效成分成为中药研究的关键问题。以中药活性物质为模板制备的硅胶表面分子印迹聚合物，具有其他分离材料所不具备的强特异性和高选择性，在中药活性成分的分离、分析中具有很好的应用前景。

综合利用分子印迹聚合物分离、分析技术，结合适合中药特点的药效和药理评价方法，设计和制备出具有高度亲和力和高度专属性的硅胶表面分子印迹聚合物材料，丰富和发展针对中药中复杂分子高效分离纯化的新方法；同时建立中药及其复方药效物质结构分析（在线结构解析）、高效、快速的药效评价新技术、新方法。

3.血清药理学测试中入血成分分析技术

中药血清药理学是在体外实验的基础上加以改进而形成的，是将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验方法。最大的优点是：不仅能反映药物中可吸收部分的直接作用，而且能反映药物成分在机体作用下形成的代谢产物和药物诱生的机体内源性物质的间接效果，使中药药效研究不局限于整体的功能研究，而是通过体内有效药物的主要存在部位——血清与器官、组织和细胞相互作用，观察局部功能进行观察，排除一些干扰因素的影响，便于应用细胞学和分子生物学手段，从基因、基因产物、药物受体和酶活性等诸方面阐述药物作用机制。血清中所含成分经离心等处理即可进行各种色谱分析，常常应用到HPLC/DAD/MS、UPLC-MS等技术。

4.药效差示血清色谱法

当中药在对证机体内产生药效变化时，机体血清中化学组分数相应的变化差中必定最小范围而最大程度地包含着真正的药效物质基础。该方法首先借助色谱法建立中药对证产生最大药效和最小药效时血清中的化学组分物质谱；然后以差示的方法表达且初步分离出该组方的体内药效物质，并将分离产物用于对证模型，以药效验证结果反馈性调整差示色谱条件，直至确认药效物质；最后结合质谱及核磁共振波谱动态定性、定量中药体内药效物质的变化，并与相应的药效研究结合，进一步确认中药的药效物质基础。该方法借助血瘀证模型，以红花为工具药，以缓解心肌缺血、改善冠脉血流等为效应指标，以红花在对证机体产生最大和最小药效时血清中物质谱的变化差为导向，以色谱、波谱等方法追踪分离和鉴定红花的药效物质。“药效差示血清色谱法”的意义在于以实现中药现代化为目标，利用现代药理、药化、分析等多种新知识、新理论，从研究机体血清化学组分数相应变化差中，寻找药效物质基础，从而为真正揭示方剂药效物质基础研究开创了一个全新局面，为研究创新中药、中药国际化奠定基础。

三、基于体内过程的方剂功效物质基础研究方法

基于ADME的方剂功效成分分析技术

方剂（中药复方）多成分、多靶点的作用特点，已得到学术界普遍认可。如何从方剂复杂功效成分群中发现功效成分（群），并阐明其在方剂功效生物效应中的作用，是方剂类方现代研究的关键问题之一。方剂类方可通过高通量的定性、定量分析获得外源性功效物质，但进入机体内的代谢过程及直接效应成分尚需对方剂/类方进入机体内的ADME过程进行研究，以明确入血成分（包括原型成分及其代谢产物）以及到达靶器官、靶组织或者靶蛋白的成分，关联其生物效应，进而揭示方剂功效成分群。

方剂功效成分群进入机体后，会出现两种不同的效应，一种是药物对机体产生的生物效应，包括治疗作用和毒副作用，即所谓的药物效应动力学，简称药效学（pharmacodynamic）和毒理学（toxicology）。另一种是机体对药物的作用，包括对药物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）、排泄（excretion）（ADME），即药物代谢动力学，简称药动学（pharmacokinetic）。体内功效成分分析即是研究中药或方剂在生物体内ADME过程中质和量的变化规律，获得功效成分群在体内各种药物代谢动力学参数，以揭示其体内直接作用的功效成分与作用机制探讨。

1.生物体内ADME过程

（1）吸收过程：

中药及方剂功效成分的吸收是指中药成分从给药部位进入血液循环的过程。除注射给药外，其他给药途径（胃肠道给药、呼吸道给药、经皮给药）均存在吸收过程。中药功效成分在到达血液循环之前会选择地通过多层半渗透性细胞膜，口服给药必须经胃肠道吸收和门静脉到肝脏后才进入血液循环。某些口服药物经过肠黏膜吸收以后，通过门静脉进入肝脏，有些药物在首次通过肝脏时，就被灭活代谢，使进入体循环的药量减少，这种现象叫首过效应（first-pass effect）。功效成分从给药部位进入血液循环过程通常用吸收速度和吸收程度来描述。吸收程度通常指生物利用度（bioavailability），即成分由给药部位到达血液循环中的相对量。中药功效成分在胃肠道的吸收是一个复杂过程，受到多种因素影响，如功效成分的理化性质（如脂溶性、通透性）、成分间相互作用、给药剂型、生理条件（如胃排空、肠道通过时间、pH值）、食物因素、胃肠道疾病等。

（2）分布过程：

中药功效成分的分布是指中药功效成分从机体的一个部位转移到另一个部位的可逆过程。不管哪一种给药途径，成分进入血液之后，随血液分布到机体各组织中，在靶组织发挥药效作用。其分布受机体生理因素及成分理化性质的影响，包括组织血流速率、生理性屏障、成分的脂溶性、成分与血浆蛋白结合情况等。同时，分布影响成分在机体各组织的浓度，对药效和毒性起到关键作用。中药成分首先分布于血流速率快的组织，然后分布到肌肉、皮肤或脂肪等血流速率慢的组织，也有部分成分会与血浆中的蛋白质结合。通常认为，游离成分才能通过生物膜，进入到相应的组织或靶器官而产生效应或进行代谢与排泄。因此，血浆蛋白结合率（rate of plasma protein binding）对成分的分布和代谢会产生影响。多数情况下，酸性成分与白蛋白结合，碱性成分与α1-酸性糖蛋白结合。另外，有些中药成分还可能和血红细胞结合。

（3）代谢过程：

中药功效成分的代谢是指功效成分经吸收、分布后，在血液和组织中发生的生物转化（biotransformation）的过程，生物转化的产物称为代谢产物（metabolites）。其主要有胃肠道、肝脏等代谢方式。

胃肠道代谢

中药绝大多数通过口服吸收而发挥作用。中药功效成分进入胃肠道之后会受到胃液及肠道菌群作用，在胃酸及酶的作用下产生水解、氧化还原等代谢反应，相对分子量减小，极性减弱，脂溶性增强。中药功效成分的肠道代谢主要是利用肠内菌群中特定的酶使之转化，多数成分代谢后被吸收，少部分成分则以原型物直接被吸收。

肠道中药物代谢酶主要分布于成熟的上皮细胞内，其中绒毛尖端活性最强。目前已经在肠道中发现众多代谢酶，如CYP2C6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等。许多功效成分为CYP3A的底物，可以在肠道内代谢。胃肠道代谢也是造成中药成分口服生物利用度偏低的重要原因之一。

肝脏代谢

肝脏是中药功效成分的主要代谢器官，具有生物转化的功能，可将进入生物体内的成分转化为代谢产物而最终排出体外。肝脏富含Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢所需的各种酶，功效成分首先在Ⅰ相代谢酶的作用下被氧化、还原或水解，然后在Ⅱ相代谢酶的作用下与葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等内源性物质结合或经甲基化、乙酰化后，随尿液和粪便排出体外。其中，在参与中药功效成分代谢的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶中，以细胞色素P450最为重要。

其他代谢

除胃肠道和肝脏之外，中药功效成分代谢的部位还有血浆、肺、皮肤、肾、鼻黏膜、脑等。随着分子生物学如蛋白质分离纯化技术、免疫抗体标记及cDNA技术的发展和应用，越来越多的药物代谢酶在肝以外组织和器官中被发现：如Ⅰ相反应的主要酶系-细胞色素P450及黄素单加氧酶、过氧化物酶、环氧化物水合酶等；Ⅱ相代谢反应的葡萄糖醛酸转移酶、硫酸转移酶、乙酰化酶、甲基化酶、氨基酸结合酶等。而且有些成分的部分代谢过程仅在肝外的特定组织进行。研究发现，绿原酸在体内的主要代谢产物为绿原酸的类似物，其主要集中在尿液。

中药功效成分在体内代谢过程中会产生活性变化。有些成分本身没有药理活性，而在体内经代谢后形成活性代谢物，又称为前体药物或前药（prodrug），如甘草酸（glycyrrhizin）本身并不能被机体吸收，在肠道菌群的作用下，分解为甘草次酸（glycyrrhetinic acid），被机体吸收而显现其药理活性。

部分中药功效成分在体内代谢后可形成毒性代谢物，对肝、肾等代谢器官造成损害。例如，冰片在体内代谢为樟脑（camphor）而产生一定的毒性；苦杏仁苷（amygdalin）在肠道内水解，其代谢产物氢氰酸具有毒性。

（4）排泄过程：

中药功效成分的排泄是指中药成分及其代谢产物经机体的排泄或分泌器官排出体外的过程。其主要排泄途径为肾脏排泄（renal excretion）和胆汁排泄（biliary excretion），其他组织器官如肺、皮肤也参与某些成分的排泄。排泄过程的特点是：①多数成分和代谢产物的排泄属于被动转运，少数成分属于主动转运；②在排泄或分泌器官中成分或代谢产物浓度较高时既具有治疗价值，同时也会造成某种程度的不良反应；③各类成分的主要排泄器官功能障碍时均能引起排泄速度减慢，产生蓄积、血药浓度增加，从而导致中毒，此时应注意调整用药剂量或给药时间间隔。

2.体内分析生物样本类型

常用的生物样品主要有血样、尿样、脏器组织和粪便等，此外，尚可选用唾液、乳汁、胆汁、羊水、泪液等作为分析样品。生物样品采集后，注意冷藏或冷冻保存，冷冻样品测定时需临时解冻，解冻后样品应一次性测定完毕，避免反复冻融。如果样品不能一次性测定完毕，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定。冷冻温度一般为-20℃，特殊情况下需在-40～-80℃贮存。

（1）血样：

所采集的血样应代表整体血药浓度，宜在血液中分布均匀后取样。多采用静脉采血方法。根据血中药物浓度和分析方法灵敏度要求，一般每次采血1～5ml，且以采血量不超过动物总血量十分之一为宜。静脉取血时，通常直接将注射器针头插入静脉血管内抽取，抽取血液移至试管或其他容器时，注意不要用力压出，最好取下针头后轻轻推出，以防血细胞破裂使血浆或血清带有红色。对于动物实验，直接从动脉或心脏取血最为理想。常见动物及人的采血量、采血方法见表3-1。

血样包括全血、血浆和血清，以血浆最为常用。血浆、血清的化学成分与组织液相近，内含药物直接与组织液接触并达到平衡，测定血浆或血清中的药物浓度比全血中的药物浓度更能反映作用部位药物浓度的变化，与药物的临床治疗作用有较好的对应关系。

血浆

血浆（plasma）是将采集的静脉血液置于含有抗凝剂的离心管中，混合后，以2 500～3 000r/min离心5～10分钟使血浆与血细胞分离，所得淡黄色上清液。血浆的量约为全血的50%～60%。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。

常用肝素作为抗凝剂。肝素是一种含硫酸的黏多糖，多用其钠盐和钾盐。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白。肝素是体内正常生理成分，因此不会改变血样的化学组成进而引起药物的变化。通常每1ml血液加入肝素0.1～0.2mg或20IU左右（1mg相当于126IU）。方法：取血前取适量肝素钠溶液，置试管等容器内，旋转试管，使肝素钠溶液均匀分布在容器壁上，干燥后加入血样，立即轻轻旋摇即可。其他抗凝剂是一些能与血液中的Ca2+结合的试剂，如EDTA、枸橼酸盐等，因其能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定，所以不常使用。

血清

血清（serum）是将采集的静脉血液置离心管中，放置30分钟到1小时，再用2 500～3 000r/min离心5～10分钟，上层澄清的淡黄色液体即为血清。血清为全血20%～40%。血浆和血清可任意选用，现有文献、资料报道的血药浓度，一般均为血浆或血清中的药物总浓度（即游离型药物和结合型药物的浓度之和）。血浆和血清都需要在采血后及时分离，最迟不超过2小时，分离后再置冰箱中保存。

全血

全血（whole blood）是将采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，不经离心操作，保持血浆和血细胞混合在一起。全血样品可冷冻贮存或直接分析。全血样品放置或自贮存处取出解冻之后，可明显分为上、下两层，上层为血浆，下层为血细胞，轻微摇动即可混匀。

（2）尿样：

尿样（urine）主要用于成分剂量回收、肾清除率、体内代谢及生物利用度等研究。尿样的收集是自然排出的尿液，属于非损伤性采样方式。但其易受食物种类、饮水量和排汗情况等影响，使尿药浓度变化较大。尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性差。受试者的肾功能直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采用尿样，婴儿或动物的排尿时间难于掌握，不易采集完全。

采集动物尿液时，一般将动物禁食过夜后，先收集空白尿，再给药，并立即放入代谢笼中，收集给药后一定时间的尿液，合并，记录体积。

采集的尿样应立即测定。若收集24小时的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂，如甲苯、二甲苯三氯甲烷及乙酸等置冰箱中保存。

（3）脏器组织：

脏器组织（organs and tissues）可为中药功效成分的吸收、分布、转运、代谢、排泄等体内过程提供重要信息，常常需要采集肝、脾、肾、肺、胃、脑等脏器进行中药成分及代谢产物的检测。方法：分别于动物给药前、给药后不同时间点处死，迅速解剖取其脏器组织，用生理盐水冲洗，除去残血，滤纸吸干。测定之前，首先均匀化，制成水基质溶液，然后再用适当方法萃取药物。组织样品制备常用的方法有：

匀浆化法

取组织检材加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测成分溶解，取上清液备用。该法简单，但回收率较低。

沉淀蛋白法

在组织匀浆中加入甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸、钨酸盐等沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液备用。该法操作简单，所得上清液常澄清透明，干扰物质较少，多被采用，但对有些成分回收率偏低。

酸水解或碱水解法

在组织匀浆中加入一定量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，滤过或离心，取上清液备用。本法适合在热酸或热碱条件下稳定的少数中药成分。

酶解法

在组织匀浆中加入一定量酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，滤过或离心，取上清液备用。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素（50～60℃活力最强）。它不仅可使组织溶解，还可使待测成分析出。本法优点是：可避免某些成分在酸或高温下降解；对与蛋白质结合紧密的药物，可提高回收率；当用有机溶剂直接提取酶解液时，则不会乳化；采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化处理，但本法不适宜在碱性下易水解的成分。

（4）粪便：

粪便（excrements）的组成四分之三是水分，其余大部分是蛋白质、无机盐、脂肪、未消化的食物纤维、脱水的消化液残余、从肠道脱落的细胞及死掉的细菌等。粪便是提供中药成分进人体内后代谢和消除情况的主要分析样品之一。粪便易于采集，但易受食物、药物、运动、睡眠等多种因素影响。采集动物粪便时，一般将动物禁食过夜，先收集空白粪便，再给药，并于代谢笼中，定时收集，称重、干燥、研碎备用。

（5）唾液：

唾液（saliva）是由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔黏膜内许多散在口腔内的小腺体分泌的，在口腔内合并成混合唾液。收集唾液是无损伤性取样，易收集。一些药物的唾液药物浓度与血浆游离药物浓度密切相关。唾液样品也可用于药物代谢动力学的研究。唾液的pH值范围为6.2～7.4，当分泌增加，碳酸氢盐含量增高，pH值会更高。唾液中蛋白质的总量接近血浆蛋白含量的十分之一左右。唾液的采集一般在漱口后15分钟左右，应尽可能在刺激少的安静状态下进行，用插入漏斗的试管接收口腔内自然流出的唾液，采集的时间至少要10分钟。唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，放置后分成泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三层。取透明部分以3 000r/min离心10分钟，取上清液作为药物浓度测定的样品，可以供直接测定或冷冻保存。

3.常用生物样品的制备方法

进行体内中药功效成分群及其代谢产物（生物样品中）分析时，一般要根据分析对象的特点及成分的存在形式、转化情况等，在测定之前采取适当的预处理技术，如分离、净化、富集等，制备成供试品溶液，以保证测定结果的科学性和准确性。

生物样品的预处理方法主要有：蛋白质沉淀法、分离纯化与浓集法、缀合物水解法、有机消化法等。

（1）除去蛋白质方法

1）蛋白质沉淀法（protein precipitation，PPT）：

即在测定血样及组织匀浆样品时，应去除蛋白质，以使结合型的待测成分释放出来，达到对待测成分纯化的目的，亦可减少对仪器设备的污染和损坏。

酸性试剂沉淀法

当pH值低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀，离心后可得到澄清的上清液。常用的强酸性沉淀剂有10%三氯乙酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5%偏磷酸等。含待测成分血清与强酸的比例为1∶0.6（V/V）混合，即可以除去90%以上的蛋白质。

有机溶剂沉淀法

加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，与蛋白质结合的中药待测成分释放出来。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1∶1～1∶3时，即可将90%上的蛋白质除去。

盐析法

加入过量的中性盐，使溶液的离子强度发生变化，中性盐能将蛋白质中的水合水分子置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。

金属盐沉淀法

当pH值高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO₄-Na₂SO₄、ZnSO₄-NaOH等。含药血清与沉淀剂的比例为1∶1～1∶3时，可以将90%以上蛋白质除去。

加热法

当待测组分热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃。蛋白沉淀后可离心或滤过除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。

2）超滤法：

超滤法是以多孔性半透膜——超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术。与通常的分离方法相比，超滤不需要加热，不需要添加化学试剂，操作条件温和，没有相态变化，具有破坏待测成分的可能性小、能量消耗少、工艺流程短等优点。适合测定超滤液中的待测成分浓度，即游离待测成分浓度。该方法简便快捷，从样本处理到测定结束耗时仅1～1.5小时，且结果稳定、可靠，已成为游离待测成分的首选方法。因所需血样量极少，尤其适合临床患者血样分析。

（2）缀合物水解方法：

待测成分或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物（conjugates）。内源性物质主要包括葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，如葡萄糖醛酸可与一些含羟基、羧基、氨基、巯基的待测成分形成葡萄糖醛酸苷缀合物；硫酸可与一些含酚羟基、芳胺及醇类待测成分形成硫酸酯缀合物。尿中药物多数呈缀合状态，与原型待测成分相比极性增大，不易被有机溶剂提取。因此，测定尿液中待测成分总量时，无论是直接测定或提取分离后测定，都需要进行水解，将缀合物中的待测成分释放出来，常用如下方法：

1）酸水解法：

通常加入适量的盐酸溶液进行水解。酸的用量、浓度、反应时间及温度等条件需通过实验来确定。该法简便、快速，但应注意在水解过程中发生的分解。

2）酶水解法：

对于遇酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法，常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶。前者可专一地水解药物的葡萄糖醛酸苷缀合物，后者水解药物的硫酸酯缀合物。在尿样处理中，最常使用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶，一般控制pH值为4.5～5.5，37℃培育数小时进行水解。本法比酸水解温和，专属性强，且不易引起被测物分解。缺点是所用时间较长，费用较高，有些酶制剂可能带入的黏蛋白会导致乳化或色谱柱阻塞。在采用本法时，还应注意事先除去尿中能抑制酶的阳离子。

3）溶剂分解法：

缀合物亦可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解，称作溶剂解。例如尿中的甾体硫酸酯在pH=1时，加乙酸乙酯提取及溶剂解，本法条件也比较温和。对于缀合物的分析，逐渐趋向于直接测定缀合物的含量，以获得中药功效成分体内代谢的更多信息。如体内以缀合物形式存在成分的量，排泄后缀合物占所有排出成分总量的比率等。

（3）分离、纯化与富集：

生物样品分析时，通常去除蛋白质之后，还需对待测成分进一步分离、纯化和富集。分离、纯化目的是除去机体其他干扰物质，富集是为了使待测成分达到一定的检测限度。

1）分离、纯化方法

液-液提取法

液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE）是基于样品中待测成分与干扰物质在互不相溶的两种溶剂中的分配系数不同进行分离、纯化的。体内多数中药成分具有亲脂性，而血样或尿样中含有的内源性物质大多亲水性较强，这样，用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。条件选择包括萃取溶剂、pH值及有机相与水相比例等。最常用的溶剂有乙醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚。本法操作简单、快速、应用广泛，但有时会发生乳化现象及被测成分的损失。

液 -固提取法

液 -固提取法（liquid-solid extraction，LSE），又称固相萃取法（solid-phase extraction，SPE），即将不同填料作为固定相装入小柱，经柱活化、加样、柱清洗、样品洗脱等步骤，使其药物或杂质保留在固定相上，再用适当溶剂将药物洗脱下来。该方法具有样品处理速度快、有机溶剂用量少、回收率高等优点，与LLE相比，避免了乳化现象，大大缩短了样品制备时间，而且便于自动化操作，特别适用于挥发性及热不稳定药物的提取。

当用SPE 分离、富集生物组织样品中的小分子分析物时，常碰到的问题是样品中的生物大分子（如蛋白质及核酸等）遇到疏水性反相固相萃取填料时会发生变性，变性后的大分子物质会吸附在填料的表面，造成填料孔径堵塞，分析物在固定相上的传质效率下降等不利现象，从而使柱效降低、吸附容量下降、萃取柱寿命缩短，最终造成对小分子分析物测定的严重干扰。涡流色谱（turbulent flow chromatography，TFC）是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。涡流色谱技术最大的特点是富集小分子化合物的同时除去生物大分子化合物，与液相色谱、质谱在线联用可对复杂的生物样品直接进样测定，而不受样品中蛋白质等大分子物质的干扰，分析速度快、效率高、灵敏度和选择性好。随着该技术的发展，已经出现了4类商品化的涡流色谱柱（反相柱、正相柱、离子交换柱、混合模式柱），其性能各有差异，对不同极性的化合物具有不同的萃取能力。

此外，柱切换（column switching）、固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）、微透析（microdialysis，MD）、膜提取（membrane extraction，ME）等适用于体内中药成分分析的提取技术可将样品预处理与分析测定方法连接起来，便于自动化操作，避免了繁琐的分离、纯化、浓缩等操作，节省了样品处理与测定时间。

2）富集方法：

经过一定处理后的生物样品，往往是微量的被测组分分布在较大体积（数毫升）的溶剂中。一些分析方法如GC法和HPLC法等都受进样量的限制，直接进样很难达到检测灵敏度要求，因此，常需要对被测组分富集后再进行测定。

生物样品常用的富集方法主要有两种：一是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量提取液测定。二是挥去提取溶剂法。可直接通入氮气流吹干。对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥形，这样可使最后数微升溶剂集中在管底部，便于量取。

（4）化学衍生化法：

有时为了提高分析检测灵敏度，或使被测组分具有更好的稳定性，或与干扰组分分离，或便于选择合适的分析方法，必须先经过衍生化反应制备成衍生物后才能进行测定。分子中含有活泼氢（如含有RCOOH、ROH、RNH₂、RNHR等官能团）的药物成分易被化学衍生化。

1）GC法中的化学衍生化：

对一些极性较大、挥发性较低以及稳定性差的组分或代谢物进行GC法测定时，不但保留时间长，而且峰形不对称或拖尾，因此需将其转变成稳定的挥发性衍生物，以提高分离分析效果。目前应用较为广泛的衍生化反应主要有硅烷化、酰化、烷基化及生成非对映异构体等衍生化方法。

硅烷化

用于具有ROH、RCOOH、RNHR等极性基团成分的衍生化。以三甲基硅烷化试剂，取代药物分子中极性基团上的活泼氢原子，生成三甲基硅烷化衍生物。

酰化

用于具有ROH、RNH₂、RNHR等极性基团药物的衍生化。

烷基化

用于具有ROH、RCOOH、RNHR等极性基团成分的衍生化。

生成非对映异构体衍生化法

具有光学异构体的成分，由于R（-）与S（+）构型不同，使之具有不同的药效和药动学特性。因此，异构体的分离也是十分重要的。分离光学异构体的方法之一，就是采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后采用GC法进行分析测定。

2）HPLC法中的化学衍生法：

在高效液相色谱分析中，对分子结构中没有紫外吸收或吸收比较弱的成分及代谢物，为了便于检测或提高分析检测灵敏度，在测定前需要将它们转变为具有较强紫外吸收或荧光的衍生物，以便于用紫外或荧光检测器进行检测。在HPLC法中，衍生化的主要目的是提高药物的检测灵敏度。

HPLC法中的化学衍生法分为：①以是否与HPLC系统联机划分为在线衍生与离线衍生两种；②以发生衍生化反应的前后区分为柱前（pre-column）衍生法与柱后（post-column）衍生法。柱前衍生法是在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。该方法具有衍生试剂、反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，衍生产物易进一步纯化，不需要附加的仪器设备等优点，但操作过程较繁琐，具有相同官能团的干扰物，也能被衍生化，影响定量的准确性。柱后衍生法是在色谱分离后，于色谱系统中加入衍生试剂及辅助反应液，与色谱流出组分直接在系统中进行反应，然后检测衍生反应的产物。该方法具有操作简便，可连续反应以实现自动化分析等优点。但在色谱系统中反应，对衍生试剂、反应时间和反应条件均有很多限制，而且还需要附加的仪器设备，如输液泵、混合室和加热器等，还会导致色谱峰展宽。常见的HPLC法中的衍生化反应及其作用见表3-2。

4.功效成分群的体内分析方法

（1）常用体内中药功效成分分析方法：

20世纪80年代初，生物样品分析多采用分光光度法、薄层色谱法、微生物学法、气相色谱法及放射免疫分析法等。随着现代分离和检测技术特别是联用分析技术的不断发展和完善，使体内中药成分分析逐步进入方法准确、灵敏、精密、技术自动化、智能化、最优化的时代，使得复杂生物样品内中药化学成分及其代谢产物的测定更加快速和准确。这些分析技术包括：超高效液相色谱法、气相色谱法及其联用技术、高效液相色谱法及其联用技术、高效毛细管电泳法及其联用技术、超临界流体色谱法、胶束色谱法、柱切换技术等分离分析方法，以及同位素标记示踪法、免疫分析法（发射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、酶联免疫吸附分析法、电化学发光免疫分析等），生物检定法（体内、体外测定法）等方法。体内中药成分分析常用分析方法及特点见表3-3。

（2）在线微透析组合UPLC-Q-TOF联用技术的体内功效成分分析技术：

利用微透析在线取样技术可以对中药多成分体内血药浓度及组织浓度进行实时检测，同时对透析液中相关内源性成分动态变化进行分析，并以此反映中药的整体药理学效应，从而获得中药多种成分的时间-浓度-效应规律。组合微透析技术可实现多种生理学指标、中药复杂多成分、生物内源性成分动态检测，整个系统包括微透析在线取样仪，生理记录仪、生化监测器、呼吸系统传感器等整体系统监测仪器，以及分子基因水平检测技术——一种在以上各种仪器基础上进行组合构建的技术体系。

微透析技术是脑内成分分析的一种有效手段，解决了以往主要以全脑匀浆法进行脑内代谢研究的问题。微透析取样过程中对动物损伤较小，在同一动物上可以进行多次采样，大大减少了动物使用数量，提高了结果的准确度和重复性。由于微透析探针半透膜的分离作用，大分子的内源性物质不能进入透析液，样品相对纯净，因此实现了微透析与HPLC-ECD/MS等分析系统的在线连接分析。生理记录仪、生化监测器、呼吸系统传感器为生物整体系统监测仪器，可以实时监测生物血压、记录和分析心率、心电图、血压、心室压、心功能，以及呼吸频率、幅度、气压、节律、流量、肺功能。在以上两种技术体系的基础上，结合分子基因水平检测技术，可以构建组合微透析技术，实现多种生理生化指标及中药复杂多成分同时检测，由此探讨中药方剂中多成分代谢与其引发的整体效应。在同一生物体上，可同时获得多种生物信息指标：①生物体内源性分子和中药复杂外源性分子代谢研究；②生物整体系统监测；③细胞基因水平指标改变。

鉴于微透析技术可以进行实时在线取样，而UPLC-Q-TOF对中药微量成分具有很好的分离度和检测限，为了对中药功效成分体内代谢过程及其对内源性物质影响的变化过程实施动态检测，可以将以上各种技术串联起来，建立微透析-UPLC-Q-TOF联用系统，从而实现对中药复杂功效成分群的体内组织分布、代谢动力学过程的实时在线分析以及代谢产物研究等。

（3）PK-PD组合微透析技术：

药物PK-PD模型反映了药物浓度-时间-效应的三维关系，体现了特定时间内药物浓度与药效之间的关系，故能描述和预测一定剂量下药物的时间-效应过程。药物动力学（PK）解释的是“机体对药物的处置”问题。PD研究只涉及时间-效应关系，未涉及效应室中药物浓度随时间变化的药效变化过程，实际情况中药效峰值出现时间常滞后于血药浓度峰值（药效与血药浓度之间存在逆时针滞后环），孤立地进行PK或PD研究不能阐明药物的体内过程，故有必要建立PK-PD结合模型，对药物的浓度-时间-效应关系进行估算，通过对靶部位药物浓度及药效的关联度分析，评估药物的体内过程。同时利用现代数据挖掘技术-人工神经网络模拟PK-PD相关性，进行多元输入与多元输出、系统对系统的复杂模型的非线性拟合。

参考文献

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