第一节　显微鉴别方法

一、载玻片与盖玻片

载玻片与盖玻片是影响显微鉴别检验的因素之一，首先应选择规格统一的载玻片（厚度0.9～1.2mm）与盖玻片（厚度0.12～0.17mm），太厚的盖玻片会影响高倍镜下观察。装片之前，应将载玻片与盖玻片用盐酸（5%）溶液浸泡数小时，有条件的可超声处理半小时，再用自来水冲洗掉盐酸溶液，最后以蒸馏水冲洗2遍，然后放入无水乙醇中浸泡或晾干备用。使用前如有需要，可用柔软的绸布或擦镜纸揩擦，至表面洁净无瑕。

市场上有部分载玻片，一端已被打磨成毛面，以便于作标记，但此种载玻片的表面经常有划伤，不适合用于中药成方制剂的显微鉴别使用，应购买未经打磨的载玻片，不仅经济，而且更适合显微鉴别检验使用。

二、装片

粉末加液体搅拌及加盖玻片时容易产生气泡，如装片时先加少量乙醇使粉末湿润，避免或减少气泡的发生；或反复将盖玻片沿一侧轻抬，亦可使多数气泡逸出；搅拌时产生的气泡可随时用解剖针将其移出。

用水或醋酸甘油装片，液体很容易挥发，应装片后立即观察。

（一）直接装片

对粉末状的散剂或胶囊剂（内容物为颗粒状的，应研细或直接置于载玻片上压碎），可不经预处理。直接取出粉末装片观察，或透化后装片观察。

对片剂、水丸剂，如无包衣，可取5片（丸）碾磨粉碎，取粉末适量装片观察或透化后装片观察；若为包衣片（丸），可用刀片刮除包衣后，碾磨，再取粉末适量装片或透化后装片观察。

对蜜丸剂可用解剖刀把蜜丸从中切开，从切面由外向内刮取少量样品，置载玻片中央，滴加少量试液，用玻璃棒搅拌均匀，按上述粉末装片法或透化后装片。

（二）预处理后装片

为了使中药成方制剂中粉末的细胞或细胞内含物能更容易地被检出，所有的中药成方制剂检品都可以预处理后再装片观察。随着用药剂量的减少，许多中药成方制剂中除部分中药饮片保持原粉投料外，其他部分经常以浸膏投料，这就需要把浸膏等带颜色的可溶性物质去掉后，再装片观察。一般有以下几种方法：

1.水合氯醛试液透化后装片

为了除去大量存在的细胞后含物，以便清楚地观察细胞组织的特征，常用水合氯醛试液进行处理，它能溶解淀粉粒、糊粉粒、叶绿体、油脂、色素、菊糖、黏液质等；还能使萎缩的细胞膨胀而恢复原形。经水合氯醛试液处理后，应加少许稀甘油封藏，以防止在冬天温度较低时水合氯醛试液析出大量杆状结晶而干扰显微鉴别特征的观察。实验室中应使用改良的水合氯醛试液，按水合氯醛-甘油-水（1∶1∶1）进行配制。

用水合氯醛试液透化时，应注意掌握操作方法，装片后用手执载玻片的一端，保持水平置小火焰上加热，并缓缓左右移动使之微沸，见气泡逸出时应立刻离开火焰，待气泡停止逸出后再放在小火焰上加热，并随时补充蒸发的液体，如此反复操作，直至粉末透明为止，放凉，滴加甘油后镜检，或直接加盖玻片镜检。

2.水洗涤后装片

将样品切碎，放入离心管或试管中，加水搅拌洗涤；如为包衣片，则用刀切去包衣后再放入容器中，加水搅拌洗涤，然后置离心管内离心沉淀或放置沉淀，如此反复数次，浸膏或赋形剂（蜂蜜或糖浆等）等水溶性物被去除，取出沉淀物装片或透化后装片观察。

3.水合氯醛试液煮沸后装片法

当处方药味较多或干扰很大，以水洗涤法仍无法去掉干扰时，显微鉴别特征较难被清楚地观察到，此时可以取少量粉末，置试管中（或小烧杯中），直接加入水合氯醛试液，加热透化，透化时保持试液微沸即可，然后再离心，用吸管吸去上清液，再以水洗涤沉淀物数次，再离心去掉上清液，取少量沉淀物，以醋酸甘油装片观察，或以水合氯醛试液装片观察。此法对于中药成方制剂中一些特征较少的药味或质量较差的中药成方制剂的显微鉴别特征的再确认有较好的效果。

（三）分别预处理法

一种中药成方制剂需要同时显微鉴别菊糖、淀粉粒、石细胞与矿物粉末等不同性质的显微鉴别特征时，可结合显微鉴别特征的具体情况，合理组合直接装片与预处理后装片，分别观察不同的显微鉴别特征。在鉴别淀粉粒及多糖等其他不宜透化的鉴别特征时，应用甘油醋酸试液（斯氏液）装片观察，或用水合氯醛试液装片不加热立即观察。在观察到菊糖、淀粉粒后，可再加热观察其他显微鉴别特征。叶子含有较多的叶绿素，表皮细胞的特征比较难以被观察，可采用3%～5%的NaOH溶液溶解掉叶绿素等色素或浸膏的颜色，便于观察叶子的表皮细胞形状或气孔等显微鉴别特征。

三、微量升华法

取金属片，放置在具圆孔（直径2cm）的石棉板（隔热作用）上，金属片上放一高度约0.8～1cm的小金属环（金属环可以用薄铁皮或铜皮自制，直径略大于圆孔），对准石棉板上的圆孔，圈内加入中药粉末一薄层，圈上放一载玻片。在石棉板下圆孔处用酒精灯徐徐加热（火焰距板约4cm）数分钟，至粉末开始变焦，去火待冷，则有结晶状升华物附着于上面的载玻片。将载玻片取下反转，在显微镜下观察结晶形状，也可按需要观察的升华物的化学性质滴加试液，观察其反应。

四、观察与记录

1.提倡使用偏光装置观察　显微特征可借助偏光装置（偏光镜）寻找和观察，尤其是淀粉粒、结晶、纤维、石细胞和导管等显微特征。

2.结晶类型的确认　在低倍镜下调至结晶清晰，在盖玻片一侧，用滴管加一滴稀醋酸试液，待试液逐渐渗入盖玻片内，结晶不溶解，再加稀盐酸溶解而无气泡发生；同法加硫酸溶液（1→2），结晶逐渐溶解，片刻后析出针状硫酸钙结晶，此结晶为草酸钙结晶。若结晶加稀盐酸溶解，同时有气泡发生，为碳酸钙结晶（钟乳体）。硅质结晶加硫酸不溶解。

3.进行显微鉴别时，应观察3～5张装片，使特征不被遗漏。每步骤观察结果均应作记录，记录要求详细、清晰、明确、真实。

4.显微观察时，应自上左至下右，呈“之”字形扫描，逐渐移动装片，全面观察目标物，描述其特征，测量其长度，逐一记录。一般应绘制简图，必要时应利用显微描绘器或显微摄影装置绘制详图或提供显微照片，并注明放大倍数，或加比例尺。

5.显微鉴别特征描述应参考现行版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）一部的书写格式、文法。书写时可省略制片过程，简写成“取本品，置显微镜下观察：”，之后描述各饮片的显微鉴别特征。

6.通常在高倍镜下进行测量结果较为准确。但要测量较长的目标物，如纤维、导管、非腺毛等，在低倍镜下测量较为方便。记录每次测量的实际数据。如浙贝母淀粉粒直径为6～56μm，表示最小量值和最大量值。测量直径时，应以物体中部为准。

五、结论

通常根据观察、记录的样品显微鉴别特征与标准规定内容或与对照药材比较是否相符，可判定其真伪或是否有掺伪，以及投料的真实性。因显微鉴别检验的专业性、技术性较强，要熟练掌握需要长期实践积累。基本原则如下：

1.制剂中的饮片以浸膏投料，却检出此饮片的粉末特征，如制片5张，每片都能检出，理论上应判不符合规定。建议研究并制定补充检验方法，等待中国食品药品检定研究院审核批准，按补充检验方法判不符合规定。对于面临的这种质量问题，不建议按《中国药典》标准显微鉴别项判不符合规定。

2.检验含饮片粉末的制剂时，当饮片粉末粒度较细而导致粉末特征被破坏，或几种药材的特征相似难以甄别，可以使用其他具显微鉴别意义的显微特征作为辅助鉴别特征，帮助判断制剂中是否投入了此种饮片原料粉末，以免出现假阴性，影响结果判断。

3.对镜检出现概率低于60%的（制片5张，检出规定特征的应不少于3张），或镜检难度大的，可以使用其他具鉴别意义的显微特征作为辅助鉴别特征，帮助判断制剂中是否投入了此种饮片原料，以免出现假阴性，影响结果判断。

4.一些多来源药材的饮片粉末制成的制剂，由于显微鉴别特征采用某一来源药材饮片特有的鉴别特征，在检验时，应予以注意。如黄连有3种来源，味连和雅连有石细胞，云连无石细胞。当碰到这类问题的中药成方制剂，建议检验单位修订标准并报国家药典委员会审批。

5.当检出一些标准规定以外的显微特征时，应查阅参考文献，同时与对照药材进行对比，以确认此种药材（饮片）是否有此种特征。如果文献与实物对照无此种粉末特征，应判不符合规定。如山药饮片被检出石细胞，处方中其他饮片都不具有此显微特征，应判不符合规定。建议检验单位研究并制定补充检验方法并获批准后，再下不符合规定的结论。