第十四章　报告基因显像

分子影像学是通过无创性的手段在细胞和/或分子水平检测活体分子过程，了解体内特异性基因或蛋白质表达的部位、水平、分布及持续时间。报告基因显像（reporter gene imaging，RGI）技术将报告基因与报告探针结合在一起，通过探针聚集显像报告基因产物的活性水平，从而间接提供报告基因表达水平及驱动报告基因表达的内源性信号或转录因子水平的信息，属于间接显像策略。由于一种报告基因的特异性表达探针可用于与该报告基因偶联的各种感兴趣靶基因的测定，能对多种不同的生物学和分子遗传学过程进行显像，不需要针对不同的报告基因报告探针系统研制不同的特异性分子探针；加之研究报告基因构建体远较研制新的分子探针简便，且能更快地应用于临床，较直接显像策略省时省力，且耗资少。由于这些优势，报告基因显像技术现已广泛地应用于动物实验研究中。本文对分子影像学中报告基因显像的一般原则、分类、相关影像学技术及潜在的临床应用作一简述。

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：①已被克隆和全序列已测定；②其表达产物能进行定量测定；③表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物。报告基因显像则是将报告基因转染给靶细胞后，通过标记的报告探针与报告基因的特异性结合而显影。通过探针的聚集显示报告基因产物的活性水平，从而间接提供报告基因表达水平及驱动报告基因表达的内源性信号或转录因子水平的信息，了解体内特异性基因或蛋白质表达的部位、水平、迁徙及持续时间。

第一节　报告基因显像的基本概念

一、报告基因显像的一般原则

报告基因表达显像必须将报告基因引入生物体内靶组织，这需借助于载体作为中介物质。目前可应用的传送载体均可用于报告基因显像中。报告基因整合入载体的方法有基因融合法、双顺反子法、双启动子法以及共载体法。报告基因显像利用上游启动子或增强子元件控制下的报告基因，共同特征是含有感兴趣报告转基因的cDNA表达盒，这些表达盒的设计和排列可以不同。比如，其可由所选择的任意启动子或增强子序列驱动。启动子可以是组成性的（导致连续转录），也可以是诱导性的（导致有控制的表达）；启动子也可具有细胞特异性，使转基因表达仅限于某些细胞或器官。报告基因就在这些特异启动子或增强子元件控制下启动转录、随后翻译成基因产物，其编码产物可以是酶、受体或转运子。报告基因显像的一个原则是如果报告基因在体内不转录，就不会导致报告探针的聚集；相反，如果启动子导致报告基因转录，报告基因mRNA的翻译将引起报告基因编码产物与报告探针发生作用从而产生可检测到的影像学信号。

理想的报告基因应符合以下条件：①为预防免疫反应，报告基因在正常宿主细胞内不表达；②特异的报告探针应仅在报告基因表达的部位聚集；③在报告基因不表达时不应有报告探针聚集；④报告基因的产物应无免疫反应；⑤报告探针在体内稳定，在达到靶目标前不被代谢；⑥报告探针应能迅速从血循环中清除，不干扰特殊信号的检出；⑦报告探针或其代谢物无细胞毒性；⑧除了转基因应用外，报告基因及其启动子应足够小以适合传送载体（质粒、病毒）；⑨自然的生物学屏障不会阻止报告探针达到靶部位；⑩影像信号应与体内报告基因mRNA和蛋白的水平有很好的相关性。但目前还没有一个报告基因或报告探针符合上述这些标准。因此可基于不同的目的开发多系统的报告基因，利用不同的成像系统同时活体监控多种报告基因的表达。已经合成了数种融合报告基因用于多模式成像，这些报告基因的产物可同时利用两种或三种影像学技术显像，在小动物研究和临床应用中具有广阔前景。

二、报告基因显像分类

RGI技术目前已有很大发展，根据报告基因的编码产物不同，可分为酶为基础的报告基因和受体或转运子为基础的报告基因，已经形成了包括放射性核素成像、MRI和光学成像的完整体系（表14-1）。

第二节　常用的报告基因显像技术

根据不同报告基因的表达产物，影像学活体示踪移植干细胞动态变化的方法主要包括放射性核素成像、MRI及光学成像，这三类技术各有优势和不足，其中最具发展前途的是放射性核素RGI系统。

一、核医学技术

放射性核素成像主要包括SPECT和PET。基于核医学技术监测体内移植干细胞的RGI主要包括四类：①基于Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（herpes simplex virus type Ⅰ thymidine kinase，HSV1-tk）和突变型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（mutant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV1-sr39tk）作为报告基因；②以跨膜受体的基因作报告基因，如多巴胺2型受体、雌激素受体和生长抑素Ⅱ型受体；③转运蛋白/底物报告基因系统，主要包括去甲肾上腺素转运蛋白和钠碘同向转运体系统等；④其他报告基因系统，包括抗原或抗体基因片段、转螯合GGC肽融合基因、酪氨酸酶基因等（图14-1）。

1.HSV1-tk报告基因系统

TK基因（thymidine kinase gene）编码脱氧胸苷激酶，在病毒、细菌和真核细胞中都存在，但不同来源tk基因的结构不同，编码的蛋白产物在相对分子质量、理化性质和生化功能上也有很大差异；应用最广泛的HSVl-tk基因序列长约3.4kb，包括5′端调控区和3′端非编码区，编码区基因全长1.3kb，有1 128个核苷酸，编码376个氨基酸，基因中无内含子，其mRNA的5′端有107个核苷酸的非编译区，其5′端侧翼序列与HSVl-tk表达水平密切相关。放射性核素（¹⁸F、¹¹C、¹²³I、¹²⁴I和 ¹³¹I）标记的核苷类似物，经主动运输通过HSVl-tk转染细胞后，被该基因的编码产物胸苷激酶磷酸化成5′-磷酸核苷，5′-磷酸核苷不能再次穿过细胞膜而“陷入”在被转染细胞中。因而，细胞内放射性活度反映了tk基因的表达。利用该系统进行的RIG可以通过以下途径实现：①直接反映tk基因在细胞内的表达；②利用双顺反子载体，将tk基因与其他治疗基因克隆在同一启动子下游，从而监测治疗基因的表达。

HSV-tk的探针主要有两类：①阿昔洛韦类衍生物，如¹⁸F标记的8-氟-9-2-羟基-1-羟甲基乙氧基甲基鸟嘌呤（FGCV）、9-3-氟-1-羟基-2-丙氧甲基鸟嘌呤（FHPG）、9-4-氟-3-羟甲基丁基鸟嘌呤（FHBG）和8-氟-9-2-羟基-1-羟甲基乙氧基甲基腺嘌呤（FACV）；②嘧啶核苷衍生物，如¹³¹I、¹²⁴I和 ¹¹C 标记的 2′-氟 -2′-脱氧 -1-β-D-阿拉伯呋喃糖-5-尿嘧啶（FIAU）。FHPG、FIAU具有本底信号低、从血液中清除快、稳定性好、安全等特性，是目前最成熟的HSV-tk报告基因显像的分子探针，可分别用于SPECT和PET显像。放射性核素显像具有较高的灵敏性，特别是PET的敏感性可达10^-12mol浓度，但SPECT、PET的空间分辨率和解剖定位能力仍然相对较差，而PET/CT（MR）和SPECT/CT的应用有效地弥补了这些不足，实现了高敏感性和高分辨率的结合。Lan 等应用 ¹³¹I-2′-fluoro-2′-deoxy-1-beta-Darabinofuranosyl-5-iodouracil（¹³¹I-FIAU）报告探针在转染HSV1-tk基因的兔模型进行SPECT心肌报告基因显像，并证实在转染HSV1-tk后1～2天心肌局部可见明显的放射性浓聚，提示该基因在局部的高表达，为缺血性心肌疾病基因治疗的监测提供了基础（图14-2）。

在随后的研究中为了提高HSV1-tk基因表达显像敏感性，Gambhir等首次使用一种HSV1-tk（mutant）型即HSV1-sr39tk，分析发现HSV1-sr39tk具有对标记探针更高的Vmax/Km，它来自于HSV1-tk基因的随机序列变异。实验表明使用HSV1-sr39tk为报告基因和阿昔洛韦类衍生物为标记探针的PET显像，比HSV1-tk的基因表达显像更佳。Zhang等的研究结果表明，将转染HSV1-sr39tk基因的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）注射到动物体内后，应用¹⁸F-FHBG PET/CT报告基因显像可以清晰显示报告基因的表达，有效的监测移植的干细胞（图14-3）。

2.受体报告基因系统

随着转基因技术的进步，受体显像在受体表达阴性肿瘤中的显像、基因治疗监测方面开辟了新的研究领域。受体基因经过转染进入肿瘤细胞后，利用标记核素的配基与之结合进行显像（标记显像核素）和靶向治疗（标记治疗性核素）。在此基础上，针对基因治疗中遇到的难于定位治疗转基因和监控疗效等问题，发展了受体介导的报告基因/报告探针。受体报告基因（receptor-based reporter gene）其基本原理是：将某些受体蛋白基因与治疗基因克隆在同一启动子下，然后利用放射性核素标记的相应的配体进行显像，观察受体基因的表达情况，从而定量间接评价治疗基因的导入部位、表达水平和持续时间。这种基因表达的非侵入性、可重复性、定量性显像将有助于人类基因治疗试验以及分子、细胞治疗动物模型的研究。

（1）多巴胺2受体（D2R）基因：

其机制为通过放射性核素标记的配体与D2R结合而在表达D2R报告基因的组织中蓄积显像。分子探针包括3-2′-¹⁸F-氟乙基螺旋哌啶酮（¹⁸F-fluoroethylspiperone，¹⁸F-FESP）、¹²³I-碘苯酰胺和 ¹¹C-raclopride等。D2R系统优点为它是相对高比活度（185～379GBq/μmol）的报告探针，但缺点是受体配体结合数量有限。应用编码多巴胺2型受体D2R的基因转染小动物模型，然后利用¹⁸F-FESP可以进行报告基因显像。Kummer等采用的HSV1-sr39tk和D2R双报告基因的单纯疱疹病毒扩增子载体用于人脑胶质瘤模型，通过PET进行定量分析证实了两种基因表达的共存。

（2）雌激素受体：

雌激素受体（estrogen receptor，ER）可位于细胞膜、细胞质或细胞核。经典的核受体位于细胞核，其蛋白质在翻译后短暂位于胞质，故可在细胞质检测到。扩散到细胞核的雌激素与其核受体结合后引发基因调控机制，调节下游基因的转录。近年研究就发现经典雌激素受体也可位于细胞膜或细胞质，雌激素与其结合后启动第二信使系统。雌激素在人体介导了很多生物学效应，而最初人们认为它的功能只受核受体的调控，即雌激素以自由扩散形式通过质膜，并与核受体紧密结合，通过结合靶基因上的雌激素应答元件（estrogen response element，ERE）调节基因表达或与其他核蛋白相互作用以改变基因的转录活性。

雌激素受体近年来也被用作一个PET的基因。Furukawa等设计一种新型的报告基因，采用¹⁸F-标记的雌二醇和人类雌激素受体配体（hERL）结合形成基因成像系统。¹⁸F-标记的雌二醇用于人体研究，而且适用的组织比较广泛，hERL和DNA结构域结合也可以用作一种转录因子，因此也可以用于基因治疗监测。Qin等应用¹⁸F-FES为报告探针在鼠模型进行PET/CT报告基因显像监测细胞和基因治疗。将转染载有报告基因hERL和治疗基因VEGF165腺病毒Ad5-hERLIRES-VEGF（Ad-EIV）的骨髓间充质干细胞注射到鼠上肢后，应用¹⁸F-FES PET/CT显像可以监测基因的表达（图14-4）。而将携带该融合基因的骨髓间充质干细胞移植到急性心肌梗死模型后，应用¹⁸F-FES PET/CT显像可以使得梗死区移植的干细胞显影，从而应用于缺血性心肌疾病干细胞移植治疗的监测（图14-5）。

（3）生长抑素受体：

生长抑素是一种在人体中广泛分布的激素，是一种G蛋白偶联的7-膜通透性受体，通过靶细胞膜上的生长抑素受体，介导和负性调节多种生理功能。生长抑素受体共有5种亚型，其中2型受体被认为与肿瘤的关系最为密切，生长抑素或生长抑素类似物可通过SSTR2抑制肿瘤细胞。SSTR2可作为报告基因，利用放射性核素标记的生长抑素类似物进行显像，通过SSTR2基因的表达情况来间接评价其基因的表达情况。生长抑素及相关类似物与受体结合后能产生抑制信号，在癌细胞中有抗增殖效应。配体包括¹¹¹In-奥曲肽、^99mTc-P829或^99mTc-P2045等。而且很多肿瘤组织对于SSTR处于高表达，利用不同核素标记，不仅可以对肿瘤进行定位诊断，还能对生长抑素治疗效应预测和受体导向内照射治疗；反之，对于低表达或不表达SSTR的肿瘤组织，则可以通过转染SSTR基因来介导SST治疗和内照射治疗，此时的SSTR基因一方面作为治疗基因参与肿瘤治疗，另一方面还可作为报告基因通过SSTR显像来对自身的表达进行监测。

3.钠碘转运体报告基因系统

钠碘转运体（sodium iodide symporter，NIS）是1996年首次从大鼠甲状腺组织中克隆出来的基因，同年研究者克隆出人的NIS。NIS位于甲状腺滤泡细胞膜上，是一种跨膜糖蛋白，是甲状腺激素生物合成中碘进入细胞的途径。其促进碘的主动转运，使碘顺着电化学梯度从间质进入细胞内。NIS转运碘的能量来自于细胞膜内向性Na⁺浓度梯度，后者是由Na⁺-K⁺-ATP酶提供的，其协同转运2个Na⁺（顺化学梯度）及1个I^-（逆化学梯度）。NIS除了能转运碘，还能转运包括^99mTc高锝酸盐在内的其他多种阴离子，而NIS的这种作用能被高氯酸钾抑制。

NIS性质独特，探针简便易得，有望成为最有前景的核素报告基因之一。NIS作为报告基因的优点是不需要用放射性核素标记底物制作特殊的核素探针，直接静脉注射¹³¹I或^99mTc高锝酸盐即可进行显像，¹³¹I或^99mTc高锝酸盐都是临床常用的核素，来源方便、价格低廉。由于^99mTc的能量较¹³¹I低，半衰期更短，其物理特性优于¹³¹I，是临床上最常用的显像剂，因而选^99mTc高锝酸盐作为NIS的探针更具临床推广价值。与其他报告基因相比，NIS还具有许多潜在的优势：①与来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶不同，NIS是一种生理性表达蛋白，理论上无免疫原性，很少会导致抗体的形成；②与NIS结合的示踪剂（^99mTcO^-、碘的放射性同位素）较¹⁸F等短半衰期正电子核素价格便宜，易于获取；③与昂贵的PET设备相比、SPECT应用更为广泛；④放射性碘和锝已经获准在临床上使用多年，更易于直接投入临床应用。

胡硕等应用NIS作为报告基因监测心肌梗死干细胞移植治疗，探讨了人钠碘转运体（hNIS）或鼠钠碘转运体（rNIS）作为报告基因监测大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）移植治疗心肌梗死的可行性。将构建的含有NIS和绿色荧光蛋白（eGFP）基因的腺病毒（Ad）质粒（Ad-eGFP-rNIS）转染到大鼠骨髓间充质干细胞，并将转染基因的rBMSCs注射到急性心肌梗死鼠模型的心肌内，然后以^99mTc-过锝酸盐（^99mTc-pertechnetate）或者¹³¹I为显像剂进行SPECT报告基因显像，并与荧光显像比较，监测移植干细胞的活性。结果表明，该法不需要特殊制备的报告探针即可显示表达NIS的移植干细胞（图14-6）。

NIS报告基因显像也能被用来监视肿瘤细胞、免疫细胞及神经干细胞的活动。hNIS基因已经被广泛地转染到肿瘤细胞，如乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、骨髓瘤等。在动物模型中，这种抗肿瘤治疗的疗效可以通过核医学仪器轻易地观测到。而带有报告基因的免疫细胞则可以被用来监视和预测抗肿瘤治疗的疗效，评估移植物抗宿主反应及检测自身免疫疾病的发病机制。此外，研究表明使用神经干细胞对中枢神经系统进行修复时，使用NIS基因作为报告基因，可以观测到神经干细胞或永生化前体细胞，移行到中枢神经系统并且进入缺损的组织。

虽然转染NIS基因到其他肿瘤的方法在显像和治疗方面显示了巨大的价值，但是这种方法在实际临床应用中仍然面临许多困难，许多必须解决的问题仍然没有得到解决。其中一条就是，在肿瘤细胞中，特别是在那些甲状腺外组织来源的肿瘤中碘的摄取、外流和相应动力学是与正常的甲状腺组织有区别的，甲状腺外组织往往不能像甲状腺一样有效地聚集和有机化碘，所以在这些组织中碘的半衰期一般都较短。对于放射性治疗来说，这就导致在肿瘤细胞中不能形成有效剂量的活性碘的聚集。

4.其他

随着报告基因的不断发展，也有其他领域的报告基因显像的涉入。如：利用某些C-末端融合肽与^99mTcO₄^-有很高的亲和力。这一系列的肽（有时称为金属结合肽）在结构上都具有连续的GGC，其中半胱氨酸的巯基可以稳定地结合^99mTc。因此导入编码这些金属结合肽基因，用^99mTc-GH显像可以间接反映其表达情况。酪氨酸酶基因也可以用来进行RGI。在该基因编码的酪氨酸酶作用下，酪氨酸被转化成黑色素，后者与金属（如¹¹¹In）具有高亲和力，被转染了该基因的细胞能够浓聚¹¹¹In。此外PBC（peptide-based celae）肽，它具有同时与金属螯合和与双链DNA结合的性质。因此可以将PBC与^99mTc螯合并与双链DNA结合，被组装在非病毒载体中，非病毒载体进入细胞后与DNA分离，利用这种方法可以比较客观的反映非病毒载体携带治疗基因的能力。

二、光学技术

活体动物体内光学成像（optical in vivo imaging）主要采用荧光（fluorescence）与生物发光（bioluminescence）两种技术。常用的报告基因是萤火虫荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因。光学成像的主要优点是无辐射，可进行实时、连续监测，敏感性较高，且花费相对较低，但由于光的穿透能力有限，仅为数毫米到数厘米，此外，由于散射的原因，光学成像的空间分辨能力有限，解剖定位能力较差，因此该技术目前多用于体表病变的观察和小动物成像研究。

1.荧光成像

最早出现的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。其中水母GFP是由238个氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27kD，GFP荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长（480nm）范围的光线激发下，会发出绿色荧光。

作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等。许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和数量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。GFP融合蛋白的荧光敏感性远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP敏感性可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其他酶类报告蛋白无法比拟的。

GFP基因是荧光成像技术常用的报告基因，由于其光谱范围位于可见光能量较低的绿光部分，组织穿透深度有限；其发射荧光需要外在光源激励；所获影像信噪比低等不足促使了许多变体（如红色荧光蛋白）及近红外线（near infrared，NIR）荧光素的开发研制，目前最长的波长已达到700～900nm。特别后者是目前研究的热点，这是因为：①远超过GFP穿透1～2mm的深度；②NIR波长区域血红蛋白、水及脂质对光子的吸收率最低，组织的自发荧光最小，所获影像信噪比最高；③NIR探针，由一段蛋白酶特异性肽序列将NIR荧光素与传送载体连接构成，因荧光共振能量转移机制在原始状态不发出荧光信号，当出现靶向蛋白溶解酶将其特异性肽底物劈裂时，荧光素与传送载体分离，因而可释放出高达几百倍的荧光。这些探针能活体无创性检测多种蛋白酶的活性、检出疾病早期的病理现象并评价治疗效果。

2.生物发光成像

生物发光成像也是广泛应用于小动物全身成像的光学技术，其优点是无自发荧光，所得影像的信噪比高，因此检测的敏感性与特异性均较高。生物发光成像的机制是酶促反应。报告基因主要有两类：虫荧光素酶基因Fluc和Renilla虫荧光素酶基因Rluc。前者编码550个氨基酸、61kD的单体蛋白，发光波长为490～620nm；后者编码36kD的单体蛋白。两者的底物分别为D-虫荧光素和coelenterazine。但是两者作用机制不同，前者的酶促反应需要ATP、Mg²⁺及O₂；后者则不需要共因子及ATP氧化底物。1995年，Contag首次在活体哺乳动物体内检测到含Lux操纵子（由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成）的病原菌，在不需要外源性底物的情况下，发出持续的可见光。1997年，他又观察到表达Fluc基因的转基因小鼠，注入底物荧光素（luciferin）后，荧光素酶蛋白与荧光素在O₂、Mg²⁺存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放，由于这种生物发光现象只有在活细胞内才会发生，而且发光强度与标记细胞的数目成正比，因此已被广泛应用于在体生物光学成像的研究中。

荧光素酶的每个催化反应只产生一个光子，通常肉眼无法直接观察到，而且光子在强散射性的生物组织中传输时，将会发生吸收、散射、反射、透射等大量光学行为。因此必须采用高敏感性的光学检测仪器（如CCD照相机采集并定量检测生物体内所发射的光子数量，然后将其转换成图像。在体生物发光成像中的发光光谱范围通常为可见光到近红外光波段，哺乳动物体内血红蛋白主要吸收可见光，水和脂质主要吸收红外线，但对波长为590～1 500nm的红光至近红外线吸收能力则较差。因此，大部分波长超过600nm的红光，经过散射、吸收后能够穿透哺乳动物组织，被生物体外的高灵敏光学检测仪器探测到，这是在体生物发光成像的理论基础。

在体生物发光成像中，采用荧光素酶光学信号标记细胞，其显著特点为：①体内检测的高敏感性；②极低的背景噪声，极高的信噪比；③由于荧光素酶和底物的特异作用而发光，特异性极强；④单位细胞的发光数量很稳定，分子标记物随目标细胞的繁衍而增多，因此外部信号与动物体内的目标细胞数成正比，不会随细胞群体数目的增多而降低信号，可用于精确定量。因此，在体生物发光成像已经成为研究活体动物体内成像的最为有效的方法；荧光素酶比绿色荧光蛋白更灵敏，但由于在体生物发光成像前，需对小动物注射荧光素酶底物，导致很难反复长时间成像，而且成像时间长，因此在不追求高敏感性的情况下，可以选用在体荧光成像。

与荧光素酶等报告基因相比，绿色荧光蛋白作为活体组织中的报告基因具有明显优势：①细胞内绿色荧光蛋白的检测仅需要激发光的激发，不需要加入底物进行酶-底物反应；②绿色荧光蛋白的表达与种属无关，无论细胞的种类和位置如何，都能在细胞内自主表达，无需其他外源的辅助因子；③绿色荧光蛋白对细胞和组织是无毒的，不会扰乱细胞的正常生长和功能；④绿色荧光蛋白能够克服穿透、毒素、光漂白等不利因素。因此，在活体细胞中基因表达、蛋白质定位和发育生物学研究中是极其有用的工具。但当受到激发光激发时，生物体的皮肤、毛发和各种组织等会产生非特异性荧光，因此在体荧光成像具有较强的背景噪声，其信噪比远远低于生物发光。而且，激发光需要穿过生物组织到达靶点，发射光再经过吸收、散射等大量光学行为从生物体内透射出来，被体外探测器接收，路径较长，因此CCD探测到的信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、生物组织的光学特性参数（如吸收系数、散射系数）等多方面因素，使得荧光强度很难精确定量，并获得发光光源的精确位置信息。

三、MRI技术

与核素成像、光学成像技术相比，磁共振有着很高的空间分辨率和组织分辨率，可在清楚显示组织解剖结构的同时对深部组织的分子影像学特征进行精细、准确的定位、定量分析，MRI在分子影像学中的应用主要包括基因表达与基因治疗成像、分子水平定量评价肿瘤血管生成、显微成像、活体细胞及分子水平评价功能性改变等方面，具有其他影像学技术不可比拟的优越性。但是它具有敏感性低的缺点，需借助一个强大的扩增系统来获得满意的图像。分子成像需要解决几个关键的问题，即有效的高亲和力成像探针，探针除具有合适的药效学，还具有克服生物传递屏障（血管、组织间隙、细胞膜）的能力；合适的扩增方法（包括化学或生物学方法）；敏感、快速而高分辨力的成像系统，其中制备特异性高亲和力的靶向探针是活体分子显像的关键因素。

目前MRI的报告基因主要有酪氨酸酶、β₂半乳糖苷酶与转铁蛋白受体基因，但这些报告基因的MR成像都需要加入外源性的造影剂，这些物质克服生物屏障，从血液、非特异组织中的清除是当前报告基因成像所面临的巨大挑战。铁蛋白基报告基因不依赖外源性的造影剂，拥有很大的优势和广阔的发展前景，特别是由于MRI具有很高的空间和时间分辨率，因此MRI活体示踪细胞方面也是一种非常有前景的技术，国内外学者做了不少这方面研究。但MRI的缺点主要是敏感性较差，其造影剂信号很难检测，造影剂不能随着细胞的分裂而自我复制，因此仅能示踪细胞的早期过程，对示踪后续的增殖和分化存在着一定的局限。

（1）转铁蛋白受体（TFR）及结合转铁蛋白（TF）：

利用转铁蛋白受体作为报告基因的研究用超氧化物微粒与转铁蛋白的复合物作为MRI分子探针。转铁蛋白受体是铁调节系统的一部分，该受体与转铁蛋白结合（一种携带铁的蛋白），并将其转运入细胞内。该受体的正常表达受负反馈调节以阻止细胞内铁的过多摄入。由于基因加工的细胞能过表达转铁蛋白，因此能在胞内聚集超氧化物微粒。铁含量的增加在梯度回波T2WI产生明显的信号改变。利用上述探针证实了可显像转铁蛋白受体表达的假设，并成功获得了转铁蛋白受体表达的MRI影像。

铁蛋白在体内的表达可以摄取组织中过多的铁，导致细胞内铁离子的浓度下降，引起细胞代偿性的增加对细胞外铁的摄取量。铁蛋白将摄取的铁储存在脱铁蛋白中心的空腔中，形成一种超顺磁性的氧化铁颗粒，即水合氧化铁，此结构导致了细胞内、外场强的不均性，使T₂弛豫时间缩短。各种因素导致的MRI表达量的变化均可引起MRI信号改变，但铁蛋白在不同的组织中结合铁的能力是不同的，而且这种差异依赖于其结合铁离子的形式是在正常条件下还是在铁负荷条件下。有作者通过研究内源性铁蛋白在肝癌细胞中的表达与磁共振弛豫率的关系，发现铁蛋白表达水平与磁共振细胞显像信号强度呈负相关。大量体内、外研究表明，铁蛋白的表达可以缩短MRI的T₂时间弛豫，但不同组织内铁蛋白表达量的差异和不同场强以及铁的负荷条件等都会影响铁蛋白所导致的MRI信号强度。

铁蛋白作为报告基因也存在着其本身的缺陷，如MRI要求短时间内要有足够的铁聚集才能引起MRI信号的改变，而随着细胞的分裂，铁蛋白摄取的铁会逐渐被稀释，但在短时间内铁蛋白摄取的铁量不可能达到细胞分裂前的水平，这样会影响成像的效果。另外，铁蛋白所引起的对比成像还依赖于铁的负荷指数，最初脱铁蛋白结合铁时引起R2升高，但当铁负荷达到一定程度时R2会下降，只有在较高铁负荷的状态下，其引起的弛豫率的增加才会保持稳定不变。

（2）β-半乳糖苷酶：

以 β-半乳糖苷酶作为报告基因的研究应用了1种叫“EgadMa”的分子探针，它由钆的不配对电子组成，周围由1个化学箍环封闭以阻止其与水分子反应，使得β₂半乳糖苷酶有活性的区域MRI信号明显增加。MRI造影剂钆螯合物可影响磁场环境，改变氢质子弛豫时间，增加弛豫率，而实验观察表明，由于β-半乳糖可以阻断钆螯合物内部水的结合位点（阻断约40%），它与钆螯合物形成的结合物会使弛豫率降低。当应用β-半乳糖苷酶水解此结合物后，钆螯合物被重新释放出来，使弛豫率恢复。这样，根据β-半乳糖苷酶水解反应前后弛豫率的变化，用MRI可以监测细胞内β-半乳糖苷酶的活性。Luoie等采用这种探针对蟾蜍胚胎干细胞编码β₂半乳糖苷酶的LacZ基因的表达进行MR成像，结果获得了LacZ基因在蟾蜍胚胎干细胞表达的MRI影像。应用β-半乳糖苷酶作为MRI的报告基因，使用钆螯合物由半乳糖，采用Gd31造影剂为对照剂。然而，在半乳糖苷酶的存在下，裂解的半乳糖单元的造影剂被释放，导致对比度增加，作为报告基因，β-半乳糖苷酶具有低背景水平的优点。

（3）酪氨酸酶：

酪氨酸酶在黑色素合成代谢中催化两个主要反应，是黑色素合成的限速酶，黑色素有较高结合铁的能力。酪氨酸酶基因的过表达可导致黑色素合成代谢增加，其结合铁的能力相应增加，从而导致MRI信号强度增加。在酪氨酸酶-黑色素系统中，酪氨酸酶是催化合成黑色素的关键酶，黑色素能与铁高效结合，使MRI的T₁弛豫时间缩短，T₁WI信号提高。MRI信号的改变可反映酪氨酸酶基因的转移与表达情况，据此可将酪氨酸酶基因作为标记基因应用于基因治疗中。另外，利用黑色素及其前体的细胞毒作用，可将酪氨酸酶基因直接作为治疗基因应用于基因治疗。

四、多模态报告基因显像

医学影像学技术发展的目标是无创性获得人体解剖、生理、分子、基因等多方面信息，以期准确诊断疾病、早期评估疗效。现有的各种影像技术各具特点，在临床和基础研究上都发挥着重要作用，众所周知，不同的影像学方法均有优缺点。核素显像灵敏，但空间分辨率低；MR显像软组织对比度最佳，但是敏感性低；生物发光及荧光显像有较好的敏感性和空间分辨率，但是穿透性差，临床应用仍需不断探索。为了解决上面的问题，近年来多模态分子影像发展方兴未艾！应用核素/MRI，核素/光学显像等不同显像模式进行疾病联合诊断，将各种影像模式的优势和特色融合兼备，实现多模式影像技术，正在成为影像领域发展的方向之一。目前，PET/CT和SPECT/CT已经较为广泛地应用于临床，核医学所提供的功能影像加上CT的解剖结构影像，能提供更加精确的定性与定量信息，提高诊断效率。此外，PET/MR、PET/超声、PET/光学成像、SPECT/MRI、SPECT/超声、SPECT/光学成像、PET/SPECT/CT等多模式影像的融合技术也逐步从研究阶段向商业实用化方向稳步发展，有可能成为临床和基础研究的重要方法和工具。

因此基于多模态影像方法的多模式报告基因系统也相继出现。Ponomarev等用HSV1-tk/GFP双报告基因成功监测了T细胞在体内的活性。Zinn，Chaudhuri等采用腺病毒载体将HSV-tk和hSSTR2、GFP和hSSTR2基因转染后，进行双RGI像用于监测皮下肿瘤。Ponomarev小组和Gambhir研究室将HSV-tk、eGFP、Fluc三种报告基因融合分别用于肿瘤的检测和干细胞的检测中。近年来国外还有一些学者采用复合模式的RGI在小动物研究中获得成功，多模式报告基因成像技术同样可用于细胞治疗的监测。

作者课题组应用三模态融合报告基因监测急性心肌梗死模型骨髓间充质干细胞移植治疗，在研究中构建了多功能分子探针TGF（包含HSV1-tk、增强绿色荧光蛋白基因eGFP和荧光素酶基因Fluc），将转染该多功能融合基因的骨髓间充质干细胞移植到心肌梗死组织后可以分别应用¹⁸F-FHBG行PET/CT显像（图14-7），同时还可进行荧光成像和生物发光成像多模态报告基因显像监测（图14-8）。

第三节　报告基因显像的应用

报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，随后逐步发展到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因已被广泛用于研究细胞生物学，随着报告基因显像技术的逐步发展，现在可以直观的用于基于表达和调控的可视化及分析。目前利用报告基因影像学技术可以无创性评价内源性分子事件、无创性显像转基因表达的部位、幅度及持续时间从而定量监控基因治疗的转导效能；评价蛋白质之间的相互作用；监控以细胞为基础的治疗中植入细胞的迁移、定位及存活等。

一、基因治疗的监测

遗传病的基因治疗（gene therapy）是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。

基因治疗研究虽然已经非常广泛，但目前临床基因治疗中仍有许多问题没有解决，如：①基因转导或转染是否成功；②转导或转染的基因是否分布到靶器官或靶组织，其分布是否最佳；③靶器官或靶组织内转基因表达是否可以产生足够的治疗效应；④转导或转染的基因是否以足够高的水平定位于其他器官或组织以诱导产生未预料的毒性反应；⑤在与前体药物联合应用时，转基因表达的最佳时机以及启动前体药物治疗的最佳时机如何；⑥转基因表达在靶组织或器官内可持续多长时间。靶组织采样的基因表达分析可以获得上述信息，但属于有创性手段，为了评价基因随时间的表达情况，需要进行连续的多次活检。由于能够无创性进行报告基因显像，将报告基因与治疗基因偶联在一起后，通过评价报告基因的表达可间接评价治疗性基因表达的位置、幅度及持续时间等信息，无疑在人类基因治疗效果的监控及评价有明显优势。

报告基因本身可以是治疗性基因，也可以与治疗性基因偶联在一起间接反映治疗性基因表达的情况，前者如利用HSV1-tk的自杀基因治疗就是一个实例；后者需要报告基因与治疗基因在转基因表达的水平上能成比例且恒定的表达。有以下策略可取得治疗性基因与报告基因表达的联系：①在两个基因之间插入内核糖体插入位点（internal ribosomal entry site，IRES）序列使其为同一启动子驱动而转录为单个mRNA，但翻译为两种不同的蛋白质。IRES元件能在双顺反子mRNA内启动转录过程，通过第一个顺反子的帽依赖性翻译和第二个顺反子的非帽依赖性IRES介导的翻译可使两个基因共表达，但第一个顺反子的帽依赖性翻译较第二个顺反子的非帽依赖性IRES介导的翻译效率高数倍；②融合法，该方法将两个或更多的基因结合在一起，其编码序列被放置在同一个阅读框架内，因此可产生具有两个原蛋白特征的单个蛋白，诸如HSV1-TK/GFP及DHRF/GFP；③利用同一载体内不同的启动子连接不同的基因；④同时输入在两个载体内克隆但由同一启动子驱动的两个基因。如前述，目前融合报告基因显像的研究受到了更多的关注，已经有多种融合报告基因进行了动物实验研究并取得了令人满意的结果。

基因治疗将外源基因通过基因转移技术将其插入患者的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病，其基于的引入方式于报告基因显像一样。分子影像和基因治疗相结合，实际就是治疗基因本身表达的可视化的成像技术。如单纯疱疹病毒TK可将阿昔洛韦前体药物向具有杀伤肿瘤细胞能力的化合物转化，例如阿昔洛韦，更昔洛韦，喷昔洛韦。因此，单纯疱疹病毒TK杀死目标细胞时，这些前体药物给药的药物浓度可以通过HSV1-tk基因表达的位置和多少由PET反复进行监控，显像剂可以采用¹⁸F-FHBG或者¹²⁴I-FIAU。此外，放射性核素标记的生长抑素类似物如⁹⁰Y-奥曲肽已用于治疗过度表达SSTR2基因的神经内分泌肿瘤，其位置和大小可以通过¹¹¹In-奥曲肽监测。此外，NIS表达的报告基因显像已经用于甲状腺癌及其监测¹³¹I的治疗中。NIS作为外源性治疗基因也在进一步的研究中，β射线杀伤靶细胞同时，也可用报告基因显像来监测。

利用双顺反子IRES法也在腺病毒载体介导的基因传送鼠中成功进行了心脏治疗性基因表达的PET显像。HSV1-tk基因表达PET显像目前已应用于临床试验中。Jacobs等提出了第一个人类的PET图像的HSV1-tk基因的表达，利用PET对5例脑胶质瘤患者进行了活体HSV-tk基因表达显像的临床试验。在神经胶质瘤患者，他们进行HSV1-TK自杀基因治疗，证实该基因在人脑胶质瘤组织功能活跃。他们分别于治疗前后运用¹²⁴I-FIAU进行了PET显像，结果证实HSV1-tk基因成功转染到人肿瘤体内。利用PET可监控体内外源性基因的表达及随时间的变化，并会对人体基因治疗标准化参数的开发以及有效安全的载体应用产生影响。近来，HSV1-TK/¹⁸F-FHBG PET用于可视化系统外源性的TK活动后的HSV1-TK基因的腺病毒瘤内注射到患者的肝细胞肝癌。在激活基因的启动子中，特定的DNA序列可以有针对性的转录因子和RNA聚合酶开始转录。特别在某些组织或细胞类型（组织/细胞特异性启动子）被激活的启动子用于基因治疗。Honigman等采用在荧光素酶报告基因的生物发光成像监测肝脏特异性（C/EBPb）的启动子转基因动物模型中的成骨细胞。使用人工PSA增强子/启动子控制表达的报告基因监测前列腺特异核抗原（PSA）在前列腺癌细胞的组织特异性表达。此外，构建治疗和报告基因成像一体化的表达系统，可同时受外源化学物质的定向诱导，如抗生素或激素治疗，并在体内以及体外细胞系统中可以通过HSV1-sr39tk基因和荧光素酶基因的监测。

二、细胞标记显像

以细胞为基础的治疗近年来得到广泛关注，如利用干细胞治疗不同疾病，如心肌梗死等显示了较为满意的效果，植入T淋巴细胞介导免疫反应以杀伤肿瘤细胞等，但植入后这些细胞是否定位于靶部位、是否存活并诱导了治疗反应等问题都迫切需要寻找合适的方法解决。虽然组织采样获得标本是评价的标准，但其有创性不适合多次连续的随访观察。利用报告基因显像技术可以无创性研究这些细胞的迁移、分布、定位及其时间动力学过程。如Koehne等利用TK基因转导细胞毒性T淋巴细胞后，监控这些细胞在供体或HLA匹配的受体内的靶向聚集及增殖。如免疫细胞和干细胞中有针对性的T-细胞的运输，使用荧光素酶的生物发光成像已被证明在几种自身免疫模型，包括胶原诱导的关节炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎，使用报告基因的分子成像也可以监测目标或治疗细胞在体内的分布。如用转铁蛋白对细胞进行标记后用MRI可高分辨示踪单个细胞，对其定位位置提供更直接的解剖印证，有望在造血干细胞移植、骨髓移植等细胞示踪显像中发挥更大作用。此外，通过报告基因显像可以对免疫反应的免疫应答激活状态无创性监测。Ponomarev等转染HSV1-tk/GFP融合基因进入活化T细胞的核因子（NFAT）响应的T-细胞系，裸鼠肿瘤中NFAT介导活化的T细胞可以通过¹²⁴I-FIAU PET显像监测。

干细胞可以分化成各种组织细胞，形成各种器官，干细胞移植治疗作为治疗组织坏死性疾病的重要手段，已成为现代医学治疗的一类重要方法，并越来越受到重视。特别是在细胞和基因的双重治疗过程中，干细胞移植梗死心肌后能存活多长时间，是保持在移植部位还是迁移了，治疗基因在体内是否高表达，持续多久，诸多问题直接影响干细胞治疗效果，以往对干细胞的监测和外源基因表达的评价，多是取心肌组织进行免疫细胞化学、RT-PCR、Western blot等有创技术来分析，不宜推广应用，因此如何实时、无创、在体监测转基因干细胞移植效果极具意义，也是当今研究的热点。近年来随着分子影像技术的快速发展，体内无创伤性监测干细胞/基因移植治疗成为可能，也是临床首选。采用报告基因显像体外监测干细胞分化也有相关报道。如Hwang等采用NIS、Luc基因和神经元特异性烯醇化酶（NSE）同一启动子调控的方法，转染到神经干细胞，在体外用环状三磷酸腺苷诱导神经分化后，可以同时采用核素和生物发光的方法进行监测。

特别在缺血性心脏疾病的移植干细胞方面，报告基因技术用于体外监测获得了较大成功。如首先采用PET和小动物PET的报告基因显像比较客观的对移植到小动物（小鼠和大鼠）心肌内的干细胞进行定位和定量分析。Willmann等在大动物（猪）上应用临床PET对心肌中移植人间充质干细胞报告基因显像的可行性报道。后来，随着多模态的分子影像的逐渐发展，多模态的分子影像也成功的用于移植心肌内的干细胞监测。Higuchi等联合应用PET和MRI监测大鼠心肌中移植细胞的存活和定位。

三、内源性基因表达的显像

报告基因影像学可用于显示靶基因的转录、转录后调节及特异的细胞内蛋白质间的相互作用。利用无创性影像学技术显示活体动物内源性基因的转录调节，可以更清晰地理解正常及癌有关的生物学过程。一些研究者设计特定的报告基因上游的启动子/增强子元件，具有特定的转录因子结合位点的控制特点。这些启动子也可以由特定的内源性转录因子激活，并随后启动特定的内源性基因。这种策略被称为作为cis-promoter/enhancer报告基因系统。一旦被激活，因为内源基因产物的表达或活化的启动子/增强子元件，成像报告基因的表达被诱导。在靶细胞或组织内的成像信号强度指示一个特定的启动子/增强子，以及一个特定的内源性基因的表达水平的活动。这有利于监控及评价新克隆的基因及新的信号转导通路、比较不同技术所获的影像、定量评价报告基因表达及其空间分布。基因表达的水平还受转录后，包括mRNA翻译过程的调节。研究显示利用PET及原位荧光活体显像可显示p53依赖的基因表达。通过在p53特异反应元件控制下放置HSV1-tk及eGEP融合基因产生逆转录病毒载体（cis-p53/tkeGFP）。研究证实DNA损伤诱导的p53转录活性上调，且与p53依赖的下游基因，包括p21的表达有关。这些结果在p53+的胶质瘤细胞中观察到，但在p53-的骨肉瘤细胞中未观察到，提示该方法可用于评价p53依赖性通路介导的新药及其他治疗方案的效果。研究显示，报告基因编码的报告蛋白及酶（DHFR-HSV1-TK）活性水平的升高发生在翻译水平而非转录水平，这些效果可通过¹²⁴I-FIAU PET显像显示，并在荷载HCT-8种植瘤的裸鼠上证实。可以遇到的情况是，当弱的启动子启动基因表达时，往往因其转录活性弱而影响内源性基因表达的显像效果，利用两步转录扩增方法（two-step transcriptional amplification，T-STA）及intrans系统法可增强启动子的转录活性，从而能增强在弱启动子驱动下基因表达的显像效果。Doubrovin等使用HSV1-TK基因，Kim等使用NIS基因作为报告基因监测激活p53的转录。有研究表明p53RE-hNIS的报告系统，其中hNIS的报告基因表达的人工增强p53的响应的元件（p53RE）的控制下，与人肝癌细胞系转染。阿霉素用于加强内源性p53的表达，阿霉素处理的细胞比未处理细胞中积累了更多的¹²⁵I。此外，阿霉素的剂量增加细胞内的¹²⁵I摄取增加，且与p53水平有显著相关性，通过Western印迹法测定。肿瘤异种移植这些细胞也显示，阿霉素治疗后增加了放射性核素积累。通过报告基因方法目前也进行了其他特定内源基因的研究，如热休克蛋白和NF-κB。

四、可视化特定的生物学现象

无创性影像内源性基因表达与细胞内的生物学现象，如信号转导、核受体激活等具有重要的意义，可以可视化。转化生长因子-β（TGF-β）的作用，可以抑制肿瘤的生长和肿瘤进展，在斯隆-凯特琳癌症中心采用报告基因技术进行了TGF-β受体的细胞内信号转导通路的成像。当这种受体由TGF-β的约束时，它激活一个特定的细胞内信号转导通路的结果是生产几个特定Smad蛋白。将HSV1-tk/GFP与Smad蛋白的融合在同一启动子控制下的逆转录病毒中。该DNA构建体转染到肿瘤细胞，并使用小鼠异种移植模型进行体内成像，通过¹⁸F-FEAU PET的图像证实Smad蛋白和TGF-β肿瘤中的受体的信号转导成功。雌激素和视黄酸核受体使用也可以采用cis-promoter/enhancer成像系统监测，NIS和荧光素酶基因与一个内部核糖体进入位点，在2个报告基因表达同时，视黄酸响应元件将被监测。So和Kang等分别在人肝癌细胞中通过表达这种DNA结构，结果显示维A酸治疗后，维A酸NIS和荧光素酶基因的表达增强。在动物肿瘤模型中，通过核素显像和光学生物发光成像发现，¹²⁵I摄取和生物发光强度均增加。

五、肿瘤显像

无创性的报告基因成像可以在基因层面了解癌症的发展、转移和治疗，用于研究肿瘤细胞活性、激活、归巢、增殖和分化。通过建立稳定转染报告基因的肿瘤细胞，可以采用影像学的手段在体外反复、连续的进行监测含有该肿瘤细胞系的动物模型。此外，还可以对该动物模型采用不同的疗法干预，采用影像学的方法活体反复监测，荧光素酶的生物发光是最广泛使用的方法。Shin等构建以MCMV为启动子含有hNIS和Fluc的人肝癌细胞的小鼠模型，通过研究发现肿瘤细胞数与核素的活性具有良好的相关性，hNIS基因的表达直观地反映了肝癌细胞的数量；在进一步的研究中，抗癌治疗的效果与核素的活性及生物光学信号均有密切的相关性；报告基因反映的信息比单纯的肿瘤重量更准确，更真实地反映了肿瘤细胞的免疫活性等情况。近年来，在肿瘤基因治疗的动物实验中，肿瘤的根除率及动物的存活率均有所提高。但是，人体肿瘤基因治疗的结果并不理想。产生这种差异的可能原因有很多，如转基因未能有效地整合到肿瘤细胞中、转染基因的表达水平不够高和表达持续时间过短等。报告基因能够通过无创的手段对基因表达的水平、分布及持续时间等进行监测，为上述问题的解决提供了广阔的思路。

六、药物筛选方面

报告基因的运用对于发现新药的效率起着至关重要的作用。由于转录因子和基因表达是药物开发过程中的重要靶标，在病毒感染、肿瘤、炎症、免疫系统疾病中都有变化，但经典基因表达的检测方法比较复杂。如果将靶基因表达的调控序列与基因相连，转染入细胞内，通过影像学技术可以动态监测调控序列对转录因子和基因表达作用的部位和持续时间，可构建合理的筛选模型，并将其转染入特异的宿主细胞中，进行具有激活靶标活性的药物的筛选。而在研究药物的药代动力学过程中，可用报告基因标记药物，通过成像技术对其进行时间和空间追踪，从而分析药物的生物利用度、排泄途径、靶专一性、药物分布以及靶的占用率等。报告基因成像技术提供了一种新的手段，加快了识别药物靶标和临床前测试，无疑将加快药物开发过程和纯化，以减少从细胞到动物和人类水平所需时间。如Cohen等将携带铁蛋白基因的质粒转染肿瘤细胞，建立稳定表达细胞株，将这种细胞移植到免疫缺陷的小鼠，形成特异性的肿瘤模型；应用MRI可以监测带有报告基因动物模型在用药前后肿瘤大小、转移等情况的变化，从而反映新药的效能。

七、蛋白质间相互作用的显像

对蛋白质相互作用的分析可获得未知功能基因的生物学作用，了解已知功能蛋白质之间的新作用及新功能，这通常利用纯粹的计算模型推导或利用大规模的蛋白质组学方法获得。无创性报告基因显像为实时显示蛋白质间的相互作用提供了新的研究手段。已经利用酵母双杂交技术及冷却充电偶联设备照相机活体检测Fluc表达，并证实MyoD和ID两种蛋白质的相互作用。Paulmurugan等还利用蛋白质互补及复原的方法显像蛋白质间的相互作用。蛋白质互补利用的是劈裂蛋白质，如其彼此接近可再度完整。这种可恢复的、但未共价再偶联的蛋白质可作为功能性底物或完整的酶。蛋白质互补介导Fluc活性恢复的原则是：Fluc的N末端通过很短的肽FFAGYC被附加到蛋白X上，而其C末端则通过肽CLKS与蛋白Y相连。蛋白X和蛋白Y相互作用通过蛋白的互补原则可恢复Fluc的活性。蛋白质复原的方法基于蛋白质拼接过程。劈裂的内含子介导蛋白质拼接导致Fluc活性恢复的原则是：Fluc的N末端通过肽FFAGYC与DnaE的N末端相连，而DnaE的N末端与蛋白X相连。同样，Fluc的C末端通过肽CLKS与DnaE的C末端相连，而DnaE的C末端与蛋白Y相连。蛋白X和蛋白Y相互作用通过DnaE的N末端和C末端的拼接而介导了Fluc活性的恢复。

八、其他

转基因动物模型的检测、转基因小鼠遗传性分析、监测细菌或病毒感染等方面，报告基因显像技术均有帮助。Maggi等人通过小动物报告基因显像技术快速、无创性的检测转基因动物模型是否成功建立。Gossen、Sacco和Wirth等人通过报告基因技术研究转基因小鼠的基因是否发生突变。也有采用¹⁴C-FMAU的放射自显影监测的在大鼠脑组织中由单纯疱疹病毒感染引起的脑炎，采用报告基因的方法实时监测细菌的感染。

九、报告基因显像应用中存在的问题

报告基因显像属于间接显像，而无法直接运用，目前研究中还存在一些明显的问题。如：①基因的免疫源性和基因突变带来的问题；②转导或转染的基因是否分布到靶器官或靶组织，其分布是否最佳；③转导或转染的基因是否以足够高的水平定位于器官或组织；④报告基因转导或转染是否成功；⑤在细胞中，报告基因表达的最佳时机如何；⑥报告基因表达在靶组织或器官内可持续多长时间。这一系列问题，也需要新的方法来解决。除了报告基因本身的一些问题外，还存在报告基因载体选择问题，特别是报告基因进入细胞内必须有合适的基因载体，目前常用的载体有非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体最常用脂质体，通过阳离子脂质体介导转染，缺点是大多数质粒载体转染效率极低，而且都是瞬时表达。病毒载体主要有非逆转录病毒载体和逆转录病毒载体，前者的代表是腺病毒载体，其优点是容纳碱基较大，但也是瞬时转染，只能进行早期示踪；后者的代表有慢病毒载体，此载体为一种理想的载体，其携带基因可以整合到宿主细胞中，可建立稳定表达细胞系，但其容纳碱基数较少，出毒量较低，也限制了其发展。

小 结

报告基因显像技术在分子影像学中起着重要作用，这些方法可以无创性研究转基因表达的部位、幅度以及持续时间，从而可以指导基因治疗过程；在转录及翻译水平的显像以及蛋白质间相互作用的无创性研究将有助于活体证实内源性基因与特异蛋白质的表达，作为基因组学与功能蛋白质组学研究技术的补充；在活体研究植入细胞的定位及分布过程可以更好地指导临床干细胞治疗及骨髓移植的顺利进行。然而这些技术目前绝大多数还处于临床前研究阶段，距离临床应用仍有一段距离。但是该领域内的研究很有可能应用于临床，使更多的人从中受益。未来研究的着眼点不仅在于加大、加深小动物报告基因显像研究的深度与力度，更应积极努力地将这些技术从实验室方法转变为临床实用的显像手段。

（兰晓莉　裴之俊）

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