第九章　微流控芯片在分子影像药物制备中的应用

第一节　微流控芯片简介

微流控学（microfludics）是在微米级结构中操控纳升至皮升体积的技术与科学，是近十多年来迅速崛起的新交叉学科。流体在微流控芯片微米级通道中，由于尺度效应导致了许多不同于宏观体系的特点，例如分子间扩散距离短、微通道的比表面积大、传热和传质速度快等特点。

自20世纪90年代初Manz和Widmer提出了以微机电加工技术（microelectromechanical systems，MEMS）为基础的“微型全分析系统”（miniaturized total analysis systems，或 micro total analysis systems，µTAS）。其目的是通过化学分析设备及化学合成装置微型化与集成化，最大限度地把化学实验室的功能转移到便携设备中，甚至集成到一定尺寸的芯片上。因此µTAS也被通俗地称为“芯片实验室”（lab-on-a-chip，LOC）。其中微流控芯片（microfluidic chips）是µTAS中最活跃的领域和发展前沿，最集中体现了将化学实验室的功能转移到芯片上的思想，该技术是一个多学科交叉的结果，既依赖于许多化学分析及合成技术的发展，也依赖于微加工技术的支持与发展，同时还依赖于应用对象（当前主要是医学和生命科学）的发展和融入。除此之外，材料、电子、光学仪器、计算机等科学领域的发展与介入也是其取得不断进展与成功所不可缺少的条件。

微流控芯片在化学分析和合成设备的微型化、集成化及便携化方面的巨大潜力促进了其在化学、生物医学、药物合成筛选、环境监测、司法鉴定、卫生检疫等众多领域的应用。例如，在生物医学领域，由于微流控芯片大规模平行处理的能力，很可能使其在人类基因组计划的进一步研究中发挥核心作用，从而成为后基因组时代的支撑性技术；在化学合成、新药筛选和开发领域，利用微流控芯片高通量、大规模、平行性等特点，可以大规模地比较各种合成路线和条件，省略大量的初步合成实验和动物实验，从而缩短研发周期，加快新药的研究开发过程；在司法鉴定领域，应用便携式微流控芯片检测装置，可以在犯罪现场检测疑犯遗留下来的唾液、血液、毛发等，并立刻与基因指纹库系统储存的DNA进行对比，从而准确、快速破案。

一、µTAS分类

当前µTAS可分为芯片式与非芯片式两大类，其中芯片式是发展重点。在芯片式µTAS中，依据芯片结构及工作机制又可分为微阵列（生物）芯片和微流控芯片，前者以微通道网络为结构特征，后者则以微探针阵列为结构特征。微流控芯片的目标是把整个化验室的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等功能集成在可多次使用的微芯片上，因此较微阵列芯片有更广泛的适用性及应用前景。

二、微流控芯片特点

1.具有极高的效率 许多微流控芯片可在数秒至数十秒时间内自动完成合成、分离、测定等复杂操作，速度常高于相对应的宏观方法1～2个数量级。其高分析或处理速度既来源于微米级通道中的高导热和传质速率（均与通道直径平方成反比），也直接来源于结构尺寸的缩小。

2.试样与试剂消耗极低 通常已低至数微升水平，目前随着技术水平的提高，已经可以进一步减少到纳升水平，既降低了贵重试剂和试样消耗，也减少了环境污染。

3.用微加工技术制作的微流控芯片部件的微小尺寸使多个部件与功能有可能集成在数平方厘米的芯片上。在此基础上易制成功能齐全的便携式仪器，用于各类现场合成与分析。

4.微流控芯片的微小尺寸使材料消耗甚微。当实现批量生产后，芯片成本可望大幅度降低，从而有利于普及。

5.在目前发展阶段的微流控芯片仍存在系统总体上既不够“微”，功能上也远达不到“全”，制作成本还难以满足推广应用的要求等缺点和不足。

三、微流控芯片分类

1.根据芯片材料的不同可分为

①硅芯片；②玻璃芯片；③石英芯片；④高聚物芯片；⑤硅-玻璃、硅-石英、玻璃-高聚物等复合材料芯片。

2.根据功能不同可分为

①高分辨分离芯片；②微采样（进样）芯片；③微检测（传感器）芯片；④细胞分析芯片；⑤前处理芯片；⑥化学合成芯片；⑦多功能集成化芯片。

第二节　微流控芯片在分子影像显像剂中的应用

一、微流控芯片在有机合成方面的优势

在微流控芯片中进行合成反应的研究已经成为微流控芯片和合成化学领域中新的研究热点之一。自1997年国外学者首次报道了微流控芯片作为一种微反应器在有机合成中的应用之后，微流控反应器（microfluidic reactors）已成功地用于合成多种有机化合物，并迅速成为当今有机合成化学的一项新技术。与常规化学反应器相比，微流控反应器具有以下特点：①微通道的宽度和深度小（一般为几十到几百微米），反应物间的扩散距离大大缩短，传质速度极快；②微通道内比表面积极大，传热效率极高；③反应条件容易控制，副反应较少；④原料、试剂用量甚微，而且反应过程中产生的环境污染物也极少；⑤在微流控芯片中得到产物的量与近代分析仪器，如气相色谱（GC）、气相色谱-质谱（GC-MS）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）的进样量相匹配，反应进程可直接用现代分析仪器在线监测，大大提高了研究合成路线的速度；⑥催化剂可固定在微通道中而得到高比表面积的催化床，提高催化效率。

二、微流控芯片在PET显像剂合成中的应用

在微流控芯片中进行PET显像剂的合成具有显著优势。首先，微流控反应合成系统可以操控非常小的反应体积，因此反应物的相对浓度高，反应速率快，从而可以大大降低底物的使用量，降低纯化的难度。其次，可以极大地缩短合成时间，真正实现按需生产。第三，能显著提高反应的放化产率。第四，反应体系小，降低防护成本，提高安全性。第五，反应芯片功能扩展性强，可以充分满足科研需要。这些特点为快速高效制备短半衰期的¹¹C，¹³N，¹⁸F放射性PET显像剂化合物提供了一个新的实验平台，在生命科学和临床医学方面具有广阔的应用前景。

目前报道的微流控反应合成系统可分为两大类，一类是由流路通道相连而成的“连续流动型”微流控反应合成系统，没有内置的阀门，构型简单，具有耐高压的优点，特别适合气-液、气-液-固多相反应，能够实现很高的反应速率。“连续流动型”系统的缺点是易交叉污染，受死体积影响大，且难以实现自动控制。另一类是由多种微单元模块组合成的微反应合成系统，这种模块式自动合成系统不但成本低廉，易于标准化及灵活集成，而且易于大规模推广和应用，有良好的产业化和市场前景。

1.连续流微流控平台

2006年Gillies等设计制作了一个能使反应物得到充分混合和传送的双芯片结构微反应器。这个微流控装置利用光刻技术，将三层钠钙玻璃板（尺寸为15mm × 15mm ×1mm）通过热键合构成一个整体。顶层用作试剂的传送，中间层和底层用50%的氢氟酸溶液刻蚀形成两个直径10mm，深度100μm的圆盘，每个微反应器的总内体积约为16μl，试剂在此处混合并进行反应。整个装置用融硅毛细管连接，使反应按顺序进行，第一个芯片用来对被保护的三氟甘露糖前体进行［¹⁸F］氟化，接着在第二个芯片上用溶于甲醇溶液的甲醇钠进行脱保护，从而获得原始的［¹⁸F］FDG，其放射化学产率（radiation chemistry yield，RCY）约为50%。由于此微反应器可以对微环境进行很好的控制，因此在芯片上的合成时间极其短暂（4～6秒），并且用该装置合成时无需加热。

2007年Steel等报道了一种可以局部加热的全自动合成［¹⁸F］FDG平台，该平台是具有两级结构的蛇形微流控装置。这个装置由玻璃材料制成，从而解决了溶剂之间不兼容的问题。当改变前体量、反应温度和流速这些参数，得到的［¹⁸F］FDG的放射化学产率非常稳定，说明微反应环境可以得到很好的控制。在1mCi到1Ci的初始活度范围内成功地合成了［¹⁸F］FDG。在250μl/min的流速下，得到了放射化学产率为40%的［¹⁸F］FDG，总合成时间为10分钟，其中包括70℃条件下2分钟的氟化过程和20℃下2分钟的脱保护过程。这个系统证明了在全自动放射合成条件下可以利用微流控装置的优势。结果还表明这个微流控系统的性能可以与商品化常规合成装置相比，展示出微流控系统用于常规合成［¹⁸F］FDG的可行性。

Wester等发表了一种基于毛细管的微流控合成装置。该装置将直径300μm，长度0.7m，内体积约为50μl的毛细管集成到一个全自动模块中快速生产［¹⁸F］FDG。毛细管是由聚四氟乙烯（poly tetra fluoro ethylene，PTFE），聚全氟乙丙烯（fluorinated ethylene propylene，FEP）和聚醚醚酮（poly ether ether ketone，PEEK）等耐有机溶剂的塑料材料制得。该装置在温度105℃，流速0.3ml/min条件下，合成［¹⁸F］FDG的总时间约为10分钟（除去¹⁸F产生过程），RCY达到88% ± 4%。与常规相同氟化条件下放化产率42% ± 5%相比，展示了毛细管微流控反应器的优势。

2.模块式集成微流控平台

与连续流微流控平台相比，Lee等设计了基于聚二甲基硅氧烷（poly dimethylsiloxane，PDMS）又称硅橡胶材质芯片为核心的模块式集成微流控合成平台。该装置在微流控芯片中集成大量的微阀、微泵，将［¹⁸F］FDG合成中的离子富集、脱水、标记和水解纯化这些功能化模块高度集成在同一块微流控芯片上。从通入稀释的¹⁸F^-溶液至生产出RCY为38%、放化纯度（radiation chemistry purity，RCP）为97.6%的［¹⁸F］FDG，整个合成过程仅需约14分钟。将此芯片的合成产物直接注射到小鼠体内，观察到了清晰的PET肿瘤分布图像。除此之外，他们还设计了第二代可以扩大生产量的简化的微流控反应芯片，这个装置是一个体积约为5μl、配有真空排气管的圆形反应器。但这类装置都使用了PDMS芯片，不能承受过高的液压和气压，且对许多溶剂的耐受性较差，因而反应类型受到很大限制。现已有一些新型耐多种有机溶剂的弹性材料可用于芯片制作，因此该技术有望用于多种反应类型的化学合成。该研究工作的另外一个特点是采用计算机辅助设计（computer aided design，CAD）来制作可用的工作芯片，整个装置制作过程可在两天时间内完成。

受Lee的研究工作启发，Elizarov等利用数值模拟和实验研究相结合的方法，对硬币形微流控合成芯片进行了进一步优化设计，制作了直径5mm，高度255μm的圆形反应器。该反应器的优点在于：①反应器的表面积大，加快了热量转移并且能较好保持了温度均一，同时加快了气体的逃脱；②这种形状促进了溶液的有效混合并使产品尽可能完全转移；③提供了足够的周长用于连接多个进口和出口。此外，该装置特别在反应室上方制作了蛇形多功能气槽，气槽与反应室之间由可透气的PDMS薄膜隔开，气槽接真空可加速反应器中水蒸气的去除。用该装置合成得到了产率为96%，产品纯度达到99.3%的［¹⁸F］FDG，可以直接用于小鼠的显像。研究结果也表明，在无需放射性物质参与反应的条件下，该方法同样能够确定反应器的最佳几何形状以及操作条件；而且利用数值模拟，无需制造新的芯片就可以探索新的芯片设计，证明了计算机数值模拟可以作为芯片设计以及操作参数优化的一个强有力的工具。

Keng等最近设计了一种利用电润湿（electrowetting on dielectric，EWOD）原理来合成PET显像剂的新的微流控装置（图9-1），这是另一种独特的模块式微流控合成平台，芯片是由耐有机溶剂的材料制得，与之前报道的模块式合成芯片系统相比，克服了PDMS芯片材料的缺点。用此装置，他们高效可靠地合成了［¹⁸F］FDG，氟化效率达 88% ± 7%（n = 11），水解纯化后，放化产率为22% ± 8%（n = 11），并且合成得到的产品重现性良好，成功用于小鼠的PET成像，并达到了用于人类PET成像的质量控制标准（如放化纯度、溶剂残留、pH等），展示了电润湿微流控合成平台的优越性。

Saiki等利用电化学沉积的方法，将¹⁸F氟化物水溶液浓缩于含有K.222-KHCO₃的MeCN溶液中（富集效率高于60%），然后稀释到一微室中，该模块可以在6分钟内生产出60μl溶于MeCN的高反应性［K⁺/K.222］¹⁸F^-，并在微反应器中进一步了合成［¹⁸F］FDG。

Wong等最近研究了电化学方法浓缩无水［¹⁸F］氟化物合成PET显像剂的反应。通过利用¹⁸F-亲核取代反应合成［¹⁸F］FDG等四种PET显像剂，取代反应在微流控反应流通池中进行，研究了反应时间、温度、前体浓度和溶剂对取代反应速率的影响，评估了浓缩在非质子溶剂中的［K +/K.222］¹⁸F复杂化合物的反应活性。在最佳条件下，获得产物的产率均等于或高于传统方法的产率。该研究证明，电化学浓缩的方法可以有效减少合成反应时间，从而增加了高温下不稳定产物的放化产率。

3.其他类型PET显像剂的微流控芯片合成应用

除了合成［¹⁸F］FDG之外，也有许多其他类型PET显像剂采用微流控芯片技术合成的报道。2004年，Lu等采用一个水力学驱动的微型反应器合成了¹¹C和¹⁸F标记的几种羧酸酯（图9-2）。反应器是一个简单的T型玻璃芯片（图9-3）。在流速为10μl/min时，反应物1和2b生成4b的衰减校正后放化产率为56%，当流速降到1μl/min时，产率增加到88%，其他几种羧酸酯的产率也随着试剂浓度的升高和流速的降低而增大（图9-4）。他们还在上述T-形微反应器中利用2-［¹⁸F］氟乙基对甲苯磺酸进行了¹⁸F-氟乙基化反应，两种反应前体通过注射泵经由进口A和B注入微通道（芯片结构见图9-3），实验观察到在室温下该反应不能进行，但将装置加热到80℃时，在流速1μl/min的条件下得到RCY为10%的合成产物，总合成时间为10分钟，该实验进一步证明了利用微反应器进行PET显像剂合成的灵活性和多样性。

2005年，Brady等利用一个相似的玻璃微反应器，对含有-NH，-OH和-SH等官能团的各种基体进行了¹¹C标记，利用［¹¹C］CH₃进行直接的¹¹C甲基化。从微反应器中得到的放射性混合物可以利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）快速简便地分离开来，得到的小体积放射性显像剂有利于安全静脉注射管理。

因为许多生物活性物质都含有羧基，例如酰胺、酯类、内酰胺和内酯，所以利用［¹¹C］CO的¹¹C羧基化反应在显像剂中引入¹¹C标记羧基官能团是一种非常有效的方法。但是，将气相的［¹¹C］CO直接引入微反应器进行标记合成具有很多困难：

（1）［¹¹C］CO捕获效率很低，加之试剂之间混合不完全导致产物的RCY较低。

（2）高温、高压以及有机溶剂的不兼容性，使得基于塑料（如PDMS）的微反应器未达到合成的最佳标准。为此Miller等设计了一个快速进行多相¹¹C羧基化反应的简易、廉价的微反应器。该微反应器的主要特点是在一个聚四氟乙烯管内装填了可重复利用的含钯催化剂的硅胶，从而提供了一个覆盖有钯催化剂的大面积活性表面，促进了合成反应的进行。利用这套装置进行了几种卤代芳烃的放射合成来标记酰胺，并有较好的产率和纯度。该研究表明，利用固定化催化剂的微管反应器对于PET显像剂合成的发展具有很大的潜能。

2009年，Briard等使用市售的连续流微反应器平台为基础，用微毛细管作为反应环，通过一步氟化的方法，合成了一种高亲和力的转运蛋白配体N-［¹⁸F］氟代乙酰基- N-（2，5-二甲氧基苄基）-2-苯氧基苯胺。该装置能耐受300psi的压力，因而可以承受过热条件（例如CH₃CN的190℃）下的合成反应。从图9-5可见在110℃、总合成时间约为4分钟条件下，获得产物12的最高RCY为85%，可以用于小鼠和猴子的micro-PET成像研究。利用同样的装置他们也合成了产物13。用类似方法，他们通过改变各种反应条件（反应环的长度，反应温度，前体体积比以及流速大小），还成功合成了广泛用于D₂受体PET显像的［¹⁸F］fallypride14，并获得了最佳RCY的产物14。Lu等也利用同样的微反应器合成得到了化合物16，Patel等用微反应器辅助反应，在160℃条件下，经过约8分钟的反应时间，将一种能够有效对代谢型谷氨酸受体进行成像的放射性配体进行标记合成，获得了RCY为31%的产物16，而通常手段用对应的溴芳前体合成所得的RCY则只有4%～6%，证明使用微反应器进行反应对合成产率提高很明显。

2010年Chun等报道了在微反应器中，由［¹⁸F］氟化物离子与二芳基碘鎓盐通过邻位取代反应快速高效地合成［¹⁸F］氟代芳烃的方法（图9-6）。在控制得当的条件下，其反应符合化学动力学规律，并由此测得了该反应的活化能。

2011年，Bejot等利用模块式微流控反应器合成了用于蛋白质标记的N-琥珀酰亚胺-4-［¹⁸F］氟苯甲酸酯（N-succinimidyl 4-［¹⁸F］fluorobenzoate，［¹⁸F］SFB）。［¹⁸F］SFB可以用于对敏感生物分子进行放射标记，但是不能通过直接的¹⁸F-亲和取代反应获得。经过微型固相纯化，最终得到放化产率（非衰减校正）55% ± 6%，RCP ＞ 98% 的［¹⁸F］SFB，获得的［¹⁸F］SFB可进一步用于标记表皮生长因子蛋白。

2012年，Selivanova等第一次成功地在连续流微反应器中一步完成对含有两种不同辅基的肽类的放射氟化（图9-7）。

Saiki等报道了采用一次性的微流控芯片进行无载体的［¹⁸F］氟化物的电化学浓缩。Gillies等将由三层聚碳酸酯（PC）材料构成的微流控平台扩展应用于¹²⁴I标记的显像剂合成，生产出了用于检测细胞死亡的显像剂¹²⁴I标记的膜联蛋白，2分钟后标记效率约40%，得到了与传统合成方法接近的结果。他们还用同样的方法，一步完成了对抗癌药物阿霉素的¹²⁴I放射碘化，2分钟内得到的标记效率约为80%。2010年，Wheeler等用放射金属 ⁶⁴Cu²⁺对 1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid（DOTA）与peptide cyclo（Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys）的螯合物进行了标记，得到的产率大于90%。

小 结

从目前的发展水平看，微流控分析芯片已突破其发展初期在加工技术及基本流控技术上的主要难关，正在进入一个开展更深入的基础研究、广泛扩大应用领域及深度产业化的转折时期。以微流控芯片为核心的系统将取代当前化学实验室的很多设备，使化学分析及合成进入病房、生产现场甚至家庭。而在过去几年中，作为一种放射标记反应的新方法，微流控反应器在合成PET显像剂方面吸引了人们的极大兴趣，基于微流控的PET放射化学的许多研究集中于反应器的设计和合成验证，许多研究者使用各自设计的微反应器完成了¹⁸F-FDG的多步放射合成。微流控反应合成系统在PET显像剂等分子影像试剂合成中的应用呈现了许多优势，例如提高了产率和纯度、加快了反应速度、可更好地控制反应进程、产物具有更好的可信度；反应过程更安全、更有效地利用了热室空间，节约了防护材料；能够节约昂贵的前体、降低分离的难度，降低了合成成本；微反应器可一次性使用，具有类似于试剂盒性质放射化学过程的质量保证；有利于自动化以及与后处理过程相集成；减少了反应体积从而获得了常规合成方法很难达到的放射性同位素浓度。以上所有这些优势的结合对于现在以及今后临床应用PET药品生产管理规范（GMP）都是极其重要和必要的。除此之外，微流控芯片开创了一条研究基础放射化学反应的崭新道路。

（张 宏　徐光明　雍蓓蓓）

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