第六章　切连科夫光学成像

切连科夫光学成像（Cerenkov luminescence imaging，CLI）是分子影像学领域的新成员。CLI结合了传统核素成像和光学成像，利用光学成像设备检测放射性核素探针产生的光学信号，对传统放射性核素显像进行了新的诠释。自从2009年CLI被首次报道用于动物体内成像以来，世界各地的研究人员相继开发出CLI的新应用和图像重建方法。CLI的迅速发展使其成为一种非常有价值和能被广泛应用的小动物分子显像模式，并有望在短期内实现临床应用。

第一节　切连科夫辐射

当介质中运动的带电粒子速度超过该介质中的光速时产生的以短波长为主的电磁辐射，称为切连科夫辐射。1934年，苏联物理学家帕维尔·阿列克谢耶维奇·切连科夫（Pavel Alekseyevich Cerenkov）首次观察到放射性液体发出蓝色辉光，因此这种现象以他的名字命名。随后苏联理论物理学家伊利亚·米哈伊洛维奇·弗兰克（Il’ja Mikhailovich Frank）和伊戈尔·叶夫根耶维奇·塔姆（Igor Yevgenyevich Tamm）成功地解释了这种现象。以他们名字命名的弗兰克-塔姆公式能够计算切连科夫辐射的强度和带电粒子频率的关系。由于切连科夫辐射在核物理和天体物理学等领域的重要应用，这三位科学家一同被授予1958年诺贝尔物理学奖。

切连科夫辐射与超音速物体发出的音爆和快船掠过水面时产生的弓形震波类似。不同的是，切连科夫辐射是由速度接近光速的带电粒子产生的。根据狭义相对论，物体运动速度不能超过真空中的光速c。但介质中的光速与折射率呈反比（公式6-1）。

例如水在室温的折射率约为1.33，光在水中仅以0.75c的速度传播。放射性核素衰变或回旋加速器可以把带电粒子加速到超过介质中的光速。通常带电粒子在介质中运行时，其自身电场可使沿途的原子发生短暂的极化和去极化。虽然去极化过程中有能量以光子形式释放，但通常无法被检测到。当带电粒子速度超过介质中的光速时，粒子会超过所产生的光，导致光在粒子周围堆积叠加产生共振，这时可以被仪器检测到。

切连科夫辐射发生的条件为粒子的速度超过介质中的光速，即放射性核素产生切连科夫辐射的主要粒子为正电子和负电子。利用公式6-2可以算出电子在介质中产生切连科夫辐射的能阈。

其中E为粒子能量，m为粒子质量，v为粒子运行速度，c为光速。

生物组织的折射系数为1.36～1.45，可以计算得出正电子和负电子产生切连科夫辐射的能阈为0.263MeV。医学常用正电子和发射负电子的核素最高能量多超过这个阈值，例如氟-18的最高能量为0.635MeV，钇-90为2.284MeV等，它们的能量均满足切连科夫辐射发生的条件。因此切连科夫辐射可以并且已经被广泛地应用于核物理、核化学及核医学检测。切连科夫辐射的强度还与带电粒子的速度和数量成比例关系。放射性核素的能量越高，其放出的带电粒子运动速度越快，切连科夫辐射也越强。

第二节　切连科夫光学成像特点

放射性核素成像是分子影像学的核心组成部分之一，在科研和临床诊断中有着广泛的应用。然而，核医学仪器的高成本往往限制了其普及。CLI作为核素成像领域的新成员，其特点是使用光学成像仪器对放射性核素成像，架起了核医学和光学显像间的桥梁。

CLI享有许多属于光学成像的优势，如成本低、易用性强、敏感性高、采集时间短等。这些特质使CLI在研究药物体内分布和药代动力学等方面具有明显优势。特别是在筛查化学及生物治疗药物、开发显像探针和放射性核素治疗药物方面，CLI可以作为初筛手段显著降低成本，选出满足一定标准的分子药物及探针，再进行较为昂贵的其他显像模式（如PET、MRI等）评估。

目前光学成像在临床应用的主要困难之一是缺乏已经批准用于临床的光学探针，而CLI具有能利用临床核医学探针的先天优势。核素成像方式如PET和SPECT等通过检测放射性核素发出的γ射线进行显像。在这个过程中，很多核素衰变时会同时释放正或负电子并满足发生切连科夫辐射的能阈。这些PET和SPECT探针都有望使用CLI进行检测。另外，特别是对基于纯β衰变的治疗性核素，如钇-90和磷-32等，目前仍缺乏有效的成像手段。CLI可以填补这个空白，对含有纯β衰变核素的探针进行显像并监测其体内分布、药代动力学等。

CLI与传统的光学成像相比具有自身的优势。虽然切连科夫辐射主要分布在紫外/蓝光区域，它也有显著的红光和近红外光发射（图6-1）。近红外区间的光线穿透组织的能力较强，因此CLI可以用于深部组织的显像。切连科夫辐射的连续谱使CLI比传统的荧光和生物发光成像拥有更宽的成像窗口和不同的波长及波段选择，有利于对光学图像进行三维重建。此外，传统荧光和生物发光探针的毒性仍有待研究，而很多可用于CLI的探针已在临床普遍应用，不存在这方面的担忧。与荧光染料相比，放射性核素往往拥有较小的分子结构，因此用于标记时，对靶标生物分子的影响也较小。值得指出的是，由于CLI是利用放射性核素的自发光，因此不需要外部的激发光。这种特性具有双重优点：切连科夫辐射的自发光既可以被用来直接用作切连科夫显像，也可以作为光源去激发其他的荧光物质或光敏化学键，从而产生新的生物医学应用，也可能提高CLI的敏感性。由于不使用外部激发光，CLI可以不受自体荧光的干扰，可能获得更好的图像信噪比。

与PET成像原理比较，CLI检测到的光学信号比正电子湮灭事件发生的更早，因此CLI有潜力实现比PET更准确的定位和更高的空间分辨率。下文将介绍的CLI在微流控芯片中的应用即是一个例子。因此CLI可应用于高分辨率组织显像和其他微观尺度设备的成像。

CLI在享有众多优势的同时也受制于一些内在缺点。首先，切连科夫辐射强度与波长的平方成反比，因此在红光和近红外光谱部分的信号强度较弱，导致CLI仍然受到光学信号穿透力弱的困扰。与此相比PET检测的511keV光子则具有极小的组织吸收和散射，因此CLI对于较深组织的敏感性和定量评价能力明显弱于PET。当然，对于浅表性疾病的临床显像和科学研究，CLI可以实现高敏感性和良好的定量分析能力。此外，在体内高血器官，如肝脏，肾脏和脾脏等，CLI的检测能力较弱。这是因为血液中的血红蛋白浓度高，颜色较深，吸收了大部分的光学信号。最后，由于使用放射性核素，CLI也存在辐射和放射性污染的风险。

综上所述，CLI不但可以作为传统核素成像方式如PET、SPECT的有益补充，还必将有力推动光学成像在生物医学基础研究和临床诊断上的应用。

第三节　切连科夫光学成像技术进展

一、放射性核素直接CLI成像

（一）β⁺核素用于CLI成像

放射性核素衰变时发出正电子的称为正电子衰变，也称为β⁺衰变。正电子是电子的反粒子，性质不稳定，遇到电子会与之发生湮灭，从而产生反方向的两个能量为511keV的γ光子。证实CLI可行性的最早动物实验是发表于2009年的直接用正电子核素来进行CLI成像。在这些早期的报道中，研究者们都选择了正电子核素作为实验对象，这与正电子核素特别是氟-18在临床上广泛应用因而容易获得有关。例如2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖（［¹⁸F］FDG）是目前临床上PET成像应用最普遍的显像剂。作为一种葡萄糖类似物，［¹⁸F］FDG会被脑、心脏及癌细胞等葡萄糖利用率高的组织细胞摄取。由于2位氧被氟取代，［¹⁸F］FDG进入细胞后无法进行糖酵解代谢，在细胞内不断蓄积，从而反映出体内组织对葡萄糖的摄取和磷酸化情况。

在氟-18敏感性成像实验中，小动物活体光学仪器对3.7kBq（0.1μCi）氟-18显像可获得高于20的信噪比（图6-2A）。［¹⁸F］FDG在每个患者的应用剂量可达到 370～740MBq（10～20mCi），因此CLI的敏感性使其具备用于临床显像的可能。对氟-18的CLI显像能够清晰地辨别直径1.2mm的小孔分辨率模型（图6-2B），CLI对氟-18成像的分辨率极限仍有待测定。在荷瘤动物模型的活体成像实验中，研究者们验证了多种肿瘤模型和氟-18探针。如图6-2C，肿瘤组织由于摄取了大量［¹⁸F］FDG，其产生的切连科夫辐射能够清晰地揭示出肿瘤的所在位置和轮廓。图6-2C显示了CLI与PET两种显像方式对同一模型动物的成像对比。CLI图像为平面图，可以提供体表的高分辨率信息。PET则能揭示体内深部器官的图像，但分辨率较低。两者存在一定互补性，可以用于多模态显像。

（二）β^-核素用于CLI成像

放射性核素释放出电子的衰变，称为β^-衰变。放出的电子与组织发生碰撞产生电离作用，直接破坏DNA分子或产生自由基损伤生物大分子，因此β^-衰变核素通常在临床上作为治疗性核素使用（图6-3）。

对β^-衰变核素的传统成像方式是利用衰变时伴生的γ射线进行SPECT成像。例如铟-111和碘-131等。但钇-90，磷-32等纯β^-衰变核素衰变时不产生γ射线，只能利用轫致辐射（bremsstrahlung）产生的高能光子来进行SPECT显像。但该方法成像效果差，敏感性低，在生物医学基础研究和临床上的应用有限。由于CLI的成像原理是基于电子发射产生的切连科夫辐射，因此可以有效地对这些核素显像。

在甲状腺中蓄积的碘-131可以被CLI清晰地显像，图6-4为β^-衰变核素动物活体CLI成像实验。该结果同时也得到了SPECT成像的验证。在另外一篇报道中，研究者对CLI和SPECT图像的定量分析表明两者非常一致，充分肯定了CLI的定量分析能力。钇-90标记的RGD-BBN多肽的肿瘤CLI显像实验结果和定量分析，更加证明了CLI对纯β^-核素成像的巨大潜力（图6-4）。

（三）α核素用于CLI显像

α粒子是电荷数为2，质量数为4的氦核，具有很强的电离能力，放射性核素衰变产生的α粒子在组织中射程比高能β粒子小很多。由于在很短的行程内将能量消耗掉，往往对组织造成较大的损伤。人们利用α粒子的这些特点设计了靶向放射性药物杀伤肿瘤细胞。在理论上，α粒子也可以产生切连科夫辐射，有的核素如锕-225也被试用于CLI成像实验。但α衰变核素衰变产生的子核素通常发生后继的β^-衰变，因此难以判断CLI检测到光子的确切来源。虽然机制尚不明确，在实践中利用CLI监测α衰变核素是可行的。

二、切连科夫光学断层扫描

与生物发光断层扫描（bioluminescence optical tomography）和荧光断层扫描（fluorescence optical tomography）类似，使用逆算法可以从CLI表面图像重建出放射性核素的三维空间位置，这种成像方式称为切连科夫发光断层扫描（Cerenkov luminescence tomography，CLT）。CLT 的难点在于数学模拟的精确性，需要考虑的因素包括不同组织的散射和吸收、组织的均一性、不同波长光线穿透组织的能力等。目前的CLT重建较为精确的方法是在CT的辅助下对主要内脏器官进行估算，得到的放射源位置与CT图像很接近，误差约在2mm以内。

CLT在科研人员的推动下正逐渐发展成为CLI技术的重要组成部分。由于深部组织对切连科夫辉光的散射和吸收，以及显像仪器及图像重建等原因，CLT的分辨率还有待进一步的提高。目前对于深部组织的精确CLI成像寄望于CLI内镜等方法的应用。

三、切连科夫辐射激发成像

切连科夫辐射可以作为光源激发荧光物质成像。荧光物质吸收短波长为主的切连科夫辐射能量，转换发出组织穿透能力强的长波长光，这个过程称为切连科夫能量转换（Cerenkov radiation energy transfer imaging）。

切连科夫辐射具有连续光谱，因此可以适应不同荧光物质的需求，同时激发这些荧光物质产生出各种不同波长的荧光。根据这个原理，可以制成自发光纳米颗粒，并实现多元光学成像（multiplexing optical imaging），激发不同探针，从而对多个靶点进行同时成像（图6-5）。荧光成像需要外界光源的激发，但激发光通常导致自体荧光从而降低信噪比。而且，激发光也受到组织的散射和吸收，大大降低激发效率。自发光相对于外界激发，可以显著减弱自体荧光和避免了组织的散射和吸收。更重要的是，这种方法可以在特定波段增强发光，显著提高CLI成像敏感性。

四、CLI监测治疗

CLI不仅可以检测放射性药物或分子探针的体内分布和药代动力学性质，还可借助许多放射性分子探针来监测药物的治疗效果。在肿瘤类疾病的治疗过程中，这种检测尤为重要。很多分子探针如［¹⁸F］FDG、［¹⁸F］FLT等可以远在患者临床体征变化之前对药物的疗效进行评价。例如当药物改变肿瘤组织的糖代谢时，可以使用［¹⁸F］FDG进行成像，与治疗前相比评价治疗效果。再如肿瘤毒性药物会抑制肿瘤细胞的生长，诱导凋亡的产生，可以利用凋亡分子探针检测肿瘤组织的摄取变化。这些手段可以帮助医生做出关键性的用药决策，及时调整药量或换用更有效的药物。目前这类检测常常需要使用大型核医学仪器如PET和SPECT。CLI的出现为监测治疗提供了新的选择。

在临床前期的基础研究中，研究者们同时利用CLI和PET两种成像方式检测治疗肿瘤效果。在治疗的不同时间点，对荷瘤小鼠模型［¹⁸F］FDG显像，研究治疗对肿瘤糖代谢的影响。对两种成像方式的定量效果的对比表明，CLI与PET的定量结果非常一致（图6-6），CLI可以作为PET的替代手段，在小鼠皮下荷瘤模型上有效地监测治疗。

五、CLI术中实时成像

手术中，医生需要准确判断病灶的边界，以便确保清除病变组织并最大限度保存正常组织。对于肿瘤手术，需要对肿瘤的局部浸润做出准确的判断，确定有无卫星病灶和跳跃病灶。如果全凭外科医生的肉眼主观判断，难免会发生病变切除不彻底导致疾病复发，或过度切除正常组织引起严重并发症。这种情况下迫切需要术中实时影像的指导。

目前光学成像的障碍之一是分子探针的开发。通过审批进入临床使用的光学分子探针寥寥无几，而核医学经过半个多世纪的广泛临床应用，拥有大量通过临床验证的放射性分子探针，为CLI的开展提供了优越的条件。

六、CLI多模态成像

由于本身使用核医学示踪剂进行光学成像，CLI具有内在的多模态成像能力。因此对于CLI成像，更容易设计三模态甚至四模态显像，充分利用不同成像方式的互补，获得更全面的成像信息。临床前实验中尝试了利用CLI/PET/MRI三种显像探针检测肿瘤前哨淋巴结。相比PET和MRI，CLI取得了更好的成像质量和更低的背景。而PET图像拥有最佳的定量效果，MRI成像能够提供清晰的解剖结构信息参考。

七、报告基因CLI成像

近年来基因治疗（gene therapy）引起了研究者的广泛关注，有望为肿瘤的治疗开辟新的途径。基因治疗是指以适当的载体，把有功能的目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因整合成为宿主遗传物质的一部分，以纠正遗传缺陷或给予细胞新的功能，从而达到治疗目的。报告基因成像能够实现对转基因的靶向性及表达水平的监测，促进基因治疗试验的开展。特别是同位素报告基因显像能够对靶基因的分布部位、数量及活性程度进行可视化的定性和定量检测，从而在治疗前预测疗效，治疗中监测基因表达，和治疗后评价疗效等方面发挥重要作用。CLI以其高敏感性和较好的分辨率也开始被用于报告基因研究。

研究者利用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（herpes simplex virus l-thymidine kinase，简称HSVl-TK）和9-［（4-氟）-3-羟基甲基丁基］鸟嘌呤（9-［（4-fluoro）-3-hydroxymethylbutyl］guanine，简称［¹⁸F］FHBG）报告基因/报告探针系统，证实了CLI对报告基因成像的可行性（图6-7）。作为相对廉价的成像方式，CLI可以与PET互为补充，降低同位素报告基因技术的成本，有力地推动报告基因研究进展。

八、其他应用（植物、TLC、高分辨率成像）

随着分子影像领域对CLI的认识不断加深，更多的研究者投入到CLI相关技术应用的开发中。CLI的新应用层出不穷，例如在微流控芯片实验室（lab-on-a-hip，LoC）中的应用。LoC能够集成实验室职能，完成合成生物分子等复杂任务。LoC的重要应用之一是放射性药物和分子探针的合成。由于体积微小，LoC可以节省空间和反应原料，并降低对系统设备的要求。重要的是，LoC易于屏蔽，有利于保护操作人员。但这项技术的发展瓶颈之一是缺乏有效的成像监测系统，难以精确地调控放射性物质的流动。研究者发现CLI可以解决这个难题。事实上，研究者发现CLI图像的分辨率非常高，对LoC成像的分辨率取决于为微流通道的宽度。例如检测到从200μm宽的通道检测到的CLI半峰全宽（full width at half maximum，FWHM）能够精确到349.4μm。从这项工作我们也可以看到CLI在细胞，组织和其他小型设备的高分辨率成像的应用潜力。

CLI还可以用于植物成像领域。同位素示踪技术在植物研究领域有着广泛应用。例如在植物营养生理的科研中，研究者应用同位素示踪技术研究光合作用、物质运转速度、物质代谢以及作物吸收等功能。与传统的液体闪烁计数器相比，CLI能够直观地显示出植物对同位素吸收和分布，实现动态观察活体植物代谢等功能。

最后要提到的是放射化学实验中，研究者常用到放射性薄层色谱法（radio thin layer chromatography，Radio TLC）对含放射性的标记混合物进行分析。CLI为Radio TLC分析提供了新的选择。研究显示，CLI可以作为工具显像和测量放射化学纯度，并具有使用方便、廉价和高通量等优点。

第四节　切连科夫光学成像应用前景

从目前的CLI科研进展来看，CLI在放射性药物和分子探针的研发和筛选上显示了强大的应用前景。由于仪器成本的显著降低和光学成像的高通量，CLI有望加快新型放射性核素分子探针和治疗药物的开发。同时，CLI可以借助放射性分子探针来监测药物的治疗效果，辅助药物的研发和临床应用。

此外，在手术应用中外科医生使用手持式γ探测仪监测放射性核素。这类仪器能够把放射性核素发出的γ射线转换成视听信号或计数，用于术中寻找转移的前哨淋巴结。CLI不但有可能能够帮助确定同位素位置，还可能提供高分辨率的图像，为外科医生提供术中实时指导。配合内镜的使用，CLI也许能够有效地对深部组织成像，为内镜手术提供有价值的指导。

应当指出，CLI仍遭受一些缺点的困扰，其中一点是切连科夫辐射的信号强度较低。随着光学检测技术敏感性的不断提高，可以预见CLI在不久的将来，在生物医学和临床研究中发挥越来越重要的作用。

（刘宏光　程 震）

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