四、糖尿病肾病致病/易感基因的研究方法及展望
（一）糖尿病肾病动物模型
与基因相关的糖尿病肾病的动物模型主要包括自发性糖尿病肾病模型和转基因糖尿病肾病模型。自发性糖尿病肾病模型指未经任何人工处理自然发生的，或由于染色体畸变、基因突变，并通过定向培育而产生的糖尿病肾病模型，如NOD小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠等；基因修饰糖尿病肾病动物模型，在动物原来遗传背景的基础上，通过改变某种基因的表达水平以建立糖尿病肾病动物模型，如eNOS敲除小鼠、转基因OVE26小鼠及BTBRob/ob小鼠等。与基因相关的糖尿病肾病的动物模型参阅本书第七章。
（二）糖尿病肾病的全基因组连锁分析
糖尿病肾病的遗传学研究，主要包括以糖尿病肾病家系为研究对象的连锁分析，和以散发性糖尿病肾病为研究对象的关联性研究。其中，全基因组连锁分析是常用的遗传学研究方法之一，其原理是通过估计某种表型与遗传标记在子代中的重组率，计算两者之间的连锁程度和遗传距离，从而获得致病位点在染色体上的定位。目前国内外已有多个对糖尿病肾病家系进行GWLS的研究，并发现了多个与糖尿病肾病显著连锁的染色体区域，例如3q24、6p、7p、7q21、7q36.1、10q、18q23.3、19q和22q等。
2002年开展的一个对多个家族成员患病的土耳其糖尿病肾病家系的连锁分析研究发现了18号染色体上的一个主要连锁峰值。该强连锁峰主要来源于肌肽酶1（carnopeptidase 1，CNDP1）的基因变异。2011年，Wessman等人在175个1型糖尿病肾病的家庭中进行全基因组连锁分析研究，采用LMS-MD10微卫星标志集，检测了384个微卫星位点，结果发现了与1型糖尿病肾病显著连锁的染色体区段22q11，并验证了先前报道的位点3q21-25和19q13。同年，FIND研究在378个家系中进行了糖尿病肾病质量性状的全基因组连锁分析，发现了与糖尿病肾病显著连锁的染色体6p，同时验证了既往报道的染色体3q、7q、10p和18q。FIND随后开展了更大的全基因组连锁分析，发现染色体3p13的rs17108位点和16q13的rs41383位点与非洲裔美国人白蛋白尿、染色体7q21.2的rs9008位点与欧洲裔美国人白蛋白尿、染色体22q12.3与墨西哥裔美国人白蛋白尿连锁，该位置是MYH9基因和APOL1基因的重叠处。2013年，FIND研究组的进一步研究还发现染色体20q11、15q12、10p12等区域与eGFR相关，且某些位点对糖尿病肾病或其表型的影响具有种族特异性。
多个家系研究结果提示糖尿病肾病存在多个易感位点/基因，而在这些候选易感区域内进行的多项关联分析研究，尚未发现明确的易感基因，考虑可能由于糖尿病肾病为多基因复杂性疾病，其遗传的异质性限制了精确定位疾病的致病区间。同时，连锁分析更适用于单基因疾病的遗传研究，而糖尿病肾病属于复杂性疾病，疾病的中效甚至弱效的变异占到比较大的比重，连锁分析的应用存在很大的局限性。
（三）糖尿病肾病的关联分析研究
糖尿病肾病的关联分析研究主要包括候选基因的关联研究及全基因组关联研究。
1.候选基因的关联分析
候选基因的关联分析是选取可能参与疾病发病机制和信号通路相关的候选基因，通过比较候选基因在病例组和对照组人群中频率分布的差异，从而发现疾病相关的易感基因。该研究主要是通过对疾病发病机制的深入研究来选取相关的候选基因。相对于连锁分析，候选基因关联研究的病例收集相对容易，可分析出明确的优势比值，得到阳性结果的概率相对较高，同时关联研究对检测中效致病基因的效能更强，被广泛应用于复杂性疾病的遗传研究。关联分析研究策略设计灵活、易于开展，是目前糖尿病肾病易感基因研究的主要手段。然而，由于糖尿病肾病的病理生理机制尚未阐明，选出的候选基因有时并非真正的疾病易感基因，具有偏倚性。
近年来国内外已有大量糖尿病肾病候选基因研究的报道，但它们的结果并不一致。既往研究发现的候选基因中，ACE I/D多态性位点是糖尿病肾病候选基因中研究较多的易感位点，同时研究还发现DD基因型与ACE水平增加相关。
近年来还有多个Meta分析评估了候选基因与糖尿病肾病的关联性，对已有的153项研究的34个位点进行Meta分析发现21个基因与糖尿病肾病显著相关。最近1项研究将免疫炎性通路上的变异位点与糖尿病肾病进行了Meta分析，发现这些炎症反应通路上的变异位点如CCL2、CCR5、IL-6、IL-8、EPO、IL-1A、IL-1B、IL-100、IL-1RN、GHRL、MMP-9、TGF-β1、VEGFA、MMP-3和MMP-12等可能与糖尿病肾病的发病相关。
大多数早期开展的候选基因关联分析研究所发现的遗传变异都无法在另一独立人群中验证，究其原因在于：种族间遗传的异质性，糖尿病肾病表型不尽相同，方法学的差异，包括样本量小，对照匹配程度差，候选基因变异的覆盖度不足，以及统计学效能低等。
2.全基因组关联分析研究
全基因组关联分析是采用高密度生物芯片对全基因组范围内的SNP进行分析，可以在整个基因组水平全面了解与疾病相关的基因变异，具有全面、高效和客观的特点。与候选基因关联分析策略不同，GWAS的分析不需要预先依据尚未充分阐明的生物学基础来假设某些特定的基因或位点与疾病相关联，因而避免了结果的偏倚性。
糖尿病肾病的首个GWAS研究于2005年在日本人群中开展，研究发现细胞能动性基因1与2型糖尿病肾病相关。2007年在2型糖尿病人群中开展的另一项GWAS研究发现，PVT1（rs2648875位点）与印第安人糖尿病的终末期肾病相关。随后的功能研究则发现敲除系膜细胞PVT1基因，ECM蛋白及其调控因子的表达显著减少，表明PVT1通过介导细胞外基质的产生，促进糖尿病肾病的发展。
FIND研究组在多种族的美国2型糖尿病人群中开展了糖尿病肾病的GWAS研究，结果发现SCAF8和CNKSR3基因间区的6q25.2（rs12523822）位点与美洲印第安人糖尿病肾病相关，并且与rs12523822高度连锁的rs955333位点与多种族人群的糖尿病肾病呈显著关联。
最近，SUMMIT研究团队开展了目前样本量最大的2型糖尿病肾病GWAS分析显示，GABRR1基因附近的新位点rs9942471与微量白蛋白尿显著关联。
关于1型糖尿病肾病，也有多个GWAS研究对其进行探讨。2009年，GENIE协作组开展了首个针对1型糖尿病人群糖尿病肾病易感基因的GWAS研究，结果未发现与糖尿病肾病显著相关的易感位点。但对GWAS研究的Meta分析发现，AFF3、RGMA/MCTP2位点与终末期肾病显著相关，SORBS1、ERBB4位点可能与1型糖尿病肾病相关。
GWAS研究结果提示多个易感基因位点与糖尿病肾病密切相关，为了解糖尿病肾病的分子遗传机制提供客观依据。然而，随着GWAS研究的深入开展，其自身的局限性也逐渐显现。同时需要指出的是，目前开展的GWAS中，糖尿病肾病患者的纳入标准并不一致，微量白蛋白尿、肾小球滤过率、血清肌酐水平、尿素氮水平和终末期肾病等都可作为患者的诊断标准，而非采用最精准的诊断方法—肾穿刺活检进行临床确认。因此，今后的研究可对研究对象进行更严格的把控，以期得出更科学的结论。
（四）糖尿病肾病易感基因定位的新的研究方法
GWAS分析中通常挑选最具有统计学差异的SNP，而忽略了其他统计学意义相对较弱的SNP，导致可能遗漏了与疾病存在较弱关联效应的基因；GWAS对常见变异的检测率较高，但难以检测低频变异及罕见变异。因此，科学家们正在探索糖尿病肾病遗传发病机制的新研究方法，如新一代测序（next generation sequencing, NGS）技术等，以弥补GWAS研究存在的对罕见和低频变异的致病基因认识的不足。
1.新一代测序技术
目前对于多基因复杂疾病的发病模式有两种，分别为“常见疾病-常见变异（common disease, common variants, CD/CV）”和“常见疾病 -罕见变异（common disease, rare variants, CD/RV）”，后者是指一些多基因复杂疾病的单个基因变异十分罕见，但每一个变异的效应却十分强大。越来越多的证据表明，罕见变异对疾病的发病影响可能较大。随着二代高通量测序技术的应用，采用外显子组测序（whole exome sequencing, WES）和/或全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）技术了解编码区和/或全基因组水平的遗传变异，包括罕见、低频变异及结构变异，以全面系统地检测疾病相关的遗传变异，是未来遗传学研究的趋势。目前采用WES和WGS方法对糖尿病肾病进行研究的报道不多。2018年，1项来自中国的小样本WES研究，共纳入了9个MODY的家族成员，包括9个确诊为MODY且肾活检确诊为糖尿病肾病的先证者和他们的第一级亲属，发现COL4A3的遗传变异与糖尿病肾病的进展相关。但这一研究样本量较小，研究结果同样有待进一步的验证。另有学者对8 577名非裔美国人群进行了外显子组测序研究，在11个不同的区域中发现了18个2型糖尿病终末期肾病的遗传变异，其中包括2个错义突变；同时发现RREB1与糖尿病肾病有很强的相关性，与之前的研究结果相符。此外，该研究还鉴定出TMEM5、SPATS2、ZIC4、HELZ2、ILDR2、LGALS3BP和RSAD2这7个与2型糖尿病终末期肾病相关的易感基因。
目前，长读长测序（long-read sequencing, LRS）属于第三代测序新技术，可以对每一条DNA分子单独测序，相信在不久的将来先进的测序技术会大大促进糖尿病肾病的遗传学研究。
2.表观遗传学
表观遗传学（epigenetics）是研究在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白转录后修饰以及非编码RNA，其状态会受到环境和生活方式的影响，且表观遗传的改变是可逆的。
表观遗传在糖尿病肾病的发病中起着重要的作用。高糖刺激可导致DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等改变，从而调控细胞内炎性反应及纤维化等基因的表达。糖尿病控制和并发症研究（DCCT）/糖尿病干预的流行病学和并发症研究（EDIC）发现即使严格控制血糖，糖尿病并发症的发生率仍然很高，这是由于细胞先前暴露于高血糖状态而涉及表观遗传修饰，这种现象被称为“代谢记忆”。
（1）DNA甲基化和糖尿病肾病：
我国学者对现有的组织特异性基因表达和甲基化的数据进行了网络分析，发现核心调控基因的不同甲基化状态可能在糖尿病肾病中扮演重要角色。已有研究表明微血管上皮细胞长期暴露于高糖状态下，会导致DNA甲基化水平的改变，进而影响基因的表达，包括糖尿病肾病中促炎症通路的激活。糖尿病也可导致肾脏近端小管的异常DNA甲基化，包括影响糖代谢和糖转运的关键基因，进而导致对降糖药物（如吡格列酮）产生耐药。同时，血糖水平升高不是影响糖尿病表观遗传修饰的唯一因素，DNA甲基化还受活性氧的影响，包括直接影响DNA的氧化调节和间接影响甲基化相关的蛋白酶。而低氧、炎症、细胞因子和生长因子、药物、营养等因素都可能对糖尿病的表观遗传修饰产生影响。
研究发现，2型糖尿病和肥胖患者的胰岛素抵抗与DNA甲基化有关。2型糖尿病患者β细胞的甲基化程度增高和空腹胰岛素水平以及胰岛素抵抗相关，表明DNA甲基化在2型糖尿病的免疫功能和代谢失调中可能起重要作用。另一项全基因组胞嘧啶甲基化研究发现，在糖尿病肾病患者中许多细胞因子均发生了甲基化水平的改变，并且这些差异表达的细胞因子主要与促肾脏纤维化相关的生物学通路相关。这些研究提示高糖诱导DNA甲基化水平改变导致炎性基因的高表达可能是糖尿病肾病发病的一个潜在病因。
有学者发现肾小管组织胞嘧啶甲基化可改善糖尿病肾病患者肾功能的下降。在印度皮马族人群糖尿病肾病相关基因被不同程度地甲基化，由此可见，DNA甲基化状态有望成为判断糖尿病肾病预后的生物标记物。同时，动物实验发现，DNA甲基化拮抗剂可以通过Sp1/NF-κB-p65-Dnmt1途径缓和足细胞损伤、蛋白尿等，更新了以往治疗糖尿病肾病的观念。高通量甲基化测序为进一步了解糖尿病肾病的发病机制提供了新的途径。有多项研究表明，2型糖尿病并伴有终末期肾病的患者和2型糖尿病无肾病的患者相比，有多个基因有显著的甲基化水平差异，其中包括之前已经报道和糖尿病肾病相关的UNC13B。对糖尿病肾病患者肾组织显微切割获取的肾小管进行甲基化水平分析，发现这些发生甲基化差异表达的基因主要集中在与肾脏纤维化相关的基因。而在1型糖尿病的研究中，与无肾病的糖尿病患者相比，有肾病的患者观察到多个基因甲基化水平的显著差异，其中包括和肾病相关并影响线粒体功能的基因。
（2）组蛋白修饰和糖尿病肾病：
组蛋白修饰包括组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化。乙酰化发生在赖氨酸残基上，主要与转录活性基因有关；而甲基化发生在赖氨酸和精氨酸残基上，根据甲基化的区域和程度引起基因活化或抑制的不同结果。
体内和体外实验表明，长期暴露于高糖的环境会导致促炎调节因子NF-κB的转录后表达水平增加。在血管上皮细胞中，通过组蛋白甲基转移酶Set7催化的高糖调节H3K4m1的信号在RELA基因的启动子中可能起着重要作用，RELA基因编码NF-κB的p65亚基；而在糖尿病患者的单核细胞中同时也发现了Set7依赖的H3K4ml信号。短暂的高糖刺激可能通过高糖调节H3K4ml的信号而诱导IL-8的产生。在糖尿病患者中，长期暴露于高糖的环境会使组蛋白乙酰化发生动态改变。在DCCT/EDIC中，对强化血糖治疗组和常规血糖治疗组的糖尿病肾病患者进行了对比，观察到了一些基因的组蛋白乙酰化的差异，单核细胞启动子中H3K9ac显著升高，并和平均糖化血红蛋白水平显著相关。这也提示了代谢记忆在血管并发症中的重要作用。
在糖尿病肾病患者的足细胞中，依赖于组蛋白修饰的糖调节氧化应激已经逐渐成为一个重要的调节因子。足细胞损伤是糖尿病肾病进展的重要预测因素，而且和肾小球硬化密切相关。组蛋白甲基化转移酶（enhancer of zeste 2 repressive complex 2，EZH2）增强子H3K27的促甲基化功能在糖尿病肾病中起着重要的调节作用，可以抑制转录因子PAX6的表达而进一步抑制硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）的表达，最终导致肾间质纤维化，影响肾功能。在糖尿病肾病中，RAAS系统中血管紧张素原异常的表观遗传改变在其发病机制中起着重要作用。
（3）非编码RNA和糖尿病肾病：
非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）主要包括短链非编码RNA（short non-coding microRNA, miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）。miRNA的异常表达在糖尿病及其并发症中均起重要作用，通过和mRNA前体部分（hnRNA）结合来调节蛋白质合成，这一特点使miRNA可以对应多个靶基因。
目前研究发现miR-21、miR-29a、miR-126、miR-214和miR-342这5种miRNA在糖尿病肾病患者中表达上调，miR-192表达降低，因此这些miRNA有望成为提示糖尿病肾病恶化或好转的预测因子，这与很多其他研究结果一致。
非编码RNA对糖尿病肾病的调控作用除了miRNA，还有lncRNA。尽管目前关于lncRNA在糖尿病肾病中的研究相对起步较晚，但仍有不少研究结果支持lncRNA在糖尿病肾病的发病机制中起的重要作用：lncRNA可以直接参与疾病的发生，也可介导TGF-β1、NF-κB、STAT3和GSK-3β等信号通路间接参与疾病的发病机制。同时，miRNA和lncRNA之间也存在复杂的联系，后者可以抑制前者与实际mRNA结合。研究表明，lncRNA TUG1、PVT1、MALAT1和NEAT1与糖尿病肾病相关。
为了更好地理解糖尿病肾病的发病机制，研究人员在其相关基因和表观遗传学方面进行了大量的研究。然而，这些结论需要经过多种方法确认，例如，研究可以通过更好地选择具有相似遗传背景的受试者来进行，从而限制人口流动、近亲结婚、文化偏好的影响，结合DNA变异和RNA调控基因甲基化的进一步研究，以及通过生物实验来确定这些变异的功能影响。