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第六节 细胞和分子遗传学的发展
细胞和分子遗传学检查与流式免疫表型分析一样,虽然不是狭义的骨髓细胞学和骨髓组织学的检查内容,但它们相互之间的互补性极强,而且在造血和淋巴组织肿瘤中以细胞和分子遗传学定义的病种或类型在不断增加,有些虽然不是定义疾病的指标,但对评判预后和指导治疗很重要。
一、细胞遗传学的发展
1888年Waldeyer提出染色体一词。1890年von Hansemann发现肿瘤细胞分裂异常,并认为可用于肿瘤诊断。1914年德国病理学家Boveri提出肿瘤细胞的分裂异常可能是染色体异常所致,认为这些染色体异常通过体细胞突变获得,具有克隆性,并于1941年提出肿瘤的染色体理论。1956年Tjio和Levan培养胎儿肺成纤维细胞中,借助低渗法扩散中期细胞染色体分裂象,确认了人类染色体数目46条,标志着人类细胞遗传学的开始。1960年Moorhead等发表末梢血染色体培养法,其简便方法促进了临床染色体研究的发展。同年Nowel和Hungerford在培养CGL患者的染色体研究中首次发现微小染色体——G组染色体长臂缩短(缺失),即以发现地的城市费城(Philadelphia, Ph)命名为Ph染色体。人类第一次将染色体异常与特定的肿瘤类型联系在一起,为Boveri提出的肿瘤染色体理论提供主要的实验证据,被认为是肿瘤细胞遗传学发展史上的一个重要的里程碑。
1968年和1970年瑞典细胞化学家Caspersson等发现用荧光染料氮芥喹吖因染色后,可使人体染色体显示明暗相间的独特带型,可以清楚地识别每一条染色体,这一技术称为Q带技术。此后通过技术改进又相继出现了G带(Seabright,1971)、C带、R带和高分辨G带等显带技术。1971年巴黎人类染色体标准会议确认了Q、G、R和C四种主要显带类型及其包含带型的数字和符号含义。1976年后应用同步化技术获得了高分辨带型,从而证实大多数肿瘤有非随机的染色体异常,特定的肿瘤有特定的染色体异常,染色体检查对肿瘤的诊断分型、预后估计和治疗选择均有重要意义。
由于造血和淋巴组织肿瘤的标本易于采集,染色体畸变类型单一而易于识别,肿瘤的染色体研究首先在造血和淋巴组织肿瘤中取得了惊人的发现(表1-5),并在短短的10~20年间发现了许多造血和淋巴组织肿瘤的重现性(recurrent)染色体异常,使造血和淋巴组织肿瘤染色体标记技术的应用进入了快速的发展期,证明白血病细胞遗传学表型与形态学类型有关,与临床治疗和预后有关,与肿瘤的生物学有关。如t(8;21)具有大原始细胞伴有成熟的AML(M2)形态表型,多见于儿童,成人较少,预后良好;t(15;17)易位更具有独特的多颗粒早幼粒细胞性白血病,并有良好的维A酸反应,成为肿瘤细胞成熟的重要模式;11q23异常则是另一组异常特征的白血病,多见于AML-M5,预后差;inv(16)或t(16;16)为具有独特的嗜酸性粒细胞增多的粒单细胞白血病,预后也较好;而有t(6;9)易位的M2和M4则示差的预后;t(8;14)(q24;q32)易位ALL为具有大原始淋巴细胞、胞质较丰富多有蜂窝样空泡的形态学特征,是FAB分型ALL-L3的特征性染色体易位,侵袭性强,恶性程度高,现在明了它是成熟B细胞肿瘤(白血病性);T系急性白血病和B系急性白血病形态学上常较难鉴别,但细胞遗传学上则有助于鉴别,14q32受累常为B系白血病/淋巴瘤,14q11、7q34和7q15区带受累常为T系恶性肿瘤。
表1-5 细胞遗传学与血液肿瘤关系的重要发现
CML为慢性粒细胞白血病,AML为急性髓细胞白血病,PV为真性红细胞增多症,APL为急性早幼粒细胞白血病,ALL为急性淋巴细胞白血病,MDS为骨髓增生异常综合征,CLL为慢性淋巴细胞白血病,DLBCL为弥漫性大B细胞淋巴瘤,MALT为黏膜相关淋巴组织
二、分子遗传学
1953年,Waston和Crick发现了脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)双螺旋的基本结构,导致了分子生物学这门新兴学科的发展。1969年Pardue和Gall建立起RNA-DNA原位杂交技术,1974年Evans等将染色体显带技术应用于染色体原位杂交,1981年Bauman首次应用荧光染料标记的DNA探针进行原位杂交,1981年Langer首次成功应用生物素标记的核苷酸探针进行原位杂交。1985年Mulleis等研制成功聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)体外扩增DNA技术。1986年Penkel改用非放射性核素——荧光标记探针完成的原位杂交即荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术,可准确检测染色体微小片段的改变和基因定位,并可直接检测间期细胞核,促进了分子遗传学的迅猛发展。1992年Kallioniemi和1993年Manoir在FISH技术的基础上建立起比较基因组杂交(comparative genome hybridization, CGH)技术,可在全部染色体或染色体亚带水平上对不同基因组间DNA序列拷贝进行检测、定位,也可以鉴定用细胞遗传学技术难以判断的肿瘤染色体的某些成分(如双微体和标记染色体)的来源。这些新技术是分子生物学研究的重要工具,也是造血和淋巴组织肿瘤分子遗传学常用的技术。20世纪70年代诞生了重组DNA技术(recombinant DNA technique),80年代开创了新一代的遗传工程,90年代开发和完善了基因测序和生物芯片(biochip)等新技术。使人们对疾病的认识深入到分子(基因)水平,成为疾病精细诊断的新方法。
在造血和淋巴组织肿瘤方面亦不例外,约在20世纪90年代前后迈入肿瘤分子血液学时代,应用分子生物学的思维和技术,提供人们进一步认识造血和淋巴组织肿瘤的分子病理及其诊断,可以评估患者预后,还进一步影响临床的治疗手段——分子靶向疗法和个体化医疗等多个领域。
造血和淋巴组织肿瘤的染色体标记率先在CML中获得突破,分子标记物研究也首先在CML标本中找到。1983年Heisterkamp等报告CML的t(9;22)(q34;q11)易位,为位于9q34断裂点的原癌基因 ABL易位至22q11区带,同年的de Klein等发现第9号染色体长臂末端的 ABL与22号染色体长臂的 BCR因染色体易位而融合组成 BCR-ABL,次年从22q11断裂点中分离了 BCR基因以及与 ABL结合的各自特定结构域,阐明了具有酪氨酸激酶活性的癌性蛋白——P210的BCR-ABL(融合蛋白)。1990年Daley等首先用实验证实BCR-ABL可使鼠发生粒细胞转化并诱发CML样疾病。1990年von Lindern发现1983年Sandberg报告见于FAB分类M2和M4且预后不佳的t(6;9)易位,为6p23上的 DEK基因与9q34上的 CAN基因发生重排而融合,有此表型者常有嗜碱性粒细胞增多,预后较差。而1991年Miyoshi和1992年Erickson等报告t(8;21)易位的受累基因表达的AML1-MTG8(融合蛋白),是儿童AML的最常见分子表型,也是AML-M2的分子标记物,有较好的预后;1993年Liu等报告1983年le Beau发现于M4Eo的inv(16)易位为 CBFB-MYH11融合,有此表型者也有良好的预后(表1-6)。
表1-6 造血和淋巴组织肿瘤中发现的主要分子标记物
续表
续表
CML为慢性粒细胞白血病,T-ALL为T细胞急性原始淋巴细胞白血病,B-ALL为B细胞急性原始淋巴细胞白血病,AML为急性髓细胞白血病,CMML为慢性粒单细胞白血病,MCL为套细胞淋巴瘤,ALCL为间变性大细胞淋巴瘤,MALT为黏膜相关淋巴组织,CEL为慢性嗜酸性粒细胞白血病,aCML为不典型慢性粒细胞白血病
1990年Borrow等,1991年de The和Kakizuka等多位学者用分子分析证明1977年Rowley等发现M3特征的t(15;17)(q22;q11-12)易位,为15q22的 PML基因与17q11-12区带上的 RARα原癌基因发生融合( PML-RARα)表达的融合蛋白之后,相继发现 RARα与另外四个伙伴基因组成M3的分子变异型。分子学检查有助于AML-M3的精细分型,不同的分子表型有着形态学和临床治疗上的某些差异。
分子生物学研究表明,分子水平上染色体易位基因重排有两种类型,其一为基因融合型,主要见于AML,如前述的融合基因(fusion gene)形成的多种AML亚型,少数见于ALL和淋巴瘤;另一为非融合型,即转录调控异常型(transcriptional disregulation type),主要见于如表1-7中所列的淋巴组织肿瘤,为原表达的原癌基因经与免疫球蛋白基因或T细胞受体基因易位后被激活,出现持续的癌基因蛋白高表达而致癌。非染色体易位所致的原癌基因点突变则是其被激活的另一分子类型,如 FMS突变与AML(Ridge等,1990), KIT突变与肥大细胞肿瘤和AML(Furitsu等,1993), FLT3( FLT-3)突变与AML(Nakao等,1996), AML1的runt结构域点突变与AML-M0和M7(Langabeer等,2002)有关。一部分 MPN1和 FLT3-TID突变与急性原始单核(或粒单)细胞白血病的杯口状核细胞(胞核凹陷超过直径25%的原始细胞)有关(FP Kroschinsky,2008)。
肿瘤基因谱研究始于20世纪90年代中期,1996年DeRisi和Brownt等首次将基因芯片(又称微阵列)技术应用于癌症研究。1998年和1999年Golub等以急性白血病为对象,应用基因芯片、形态学和免疫学等检测指标,分别建立起AML和ALL基因数据库,从中选取50个与AML和ALL发病密切相关的基因,对38例白血病样本进行分型,检查结果成功率100%,并通过监测基因表达变化,从ALL中区分出了AML。Wellmann等应用588个已知基因cDNA芯片对淋巴瘤进行特异性标记物研究,发现不同类型的淋巴瘤中存在基因差异,其中与凋亡等有关的聚集素(clusterin)基因仅见于间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALCL)。2000年Alizadeh等首次将基因表达谱与临床预后相联系,用cDNA微阵列技术对弥散性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)进行基因表达谱(gene expression profiling, GEP)检测,发现两种不同的分子类型有不同的生存率等。
表1-7 部分慢性髓系和淋系肿瘤形态学、核型和基因重排或突变型
∗现称此型为伴嗜酸性粒细胞增多与 PDGFRB重排髓系肿瘤, ∗∗现称此型为伴嗜酸性粒细胞增多与 PDGFRA重排髓系肿瘤
因此,造血和淋巴组织肿瘤中,不论是急性还是慢性,是髓系还是淋巴系,分子学等检查可提供精细的诊断信息和治疗方案的依据,还能解释一些疾病发病的分子原理。基因芯片技术应用于肿瘤,除了提供基因诊断信息外,还可进行病情预测、定位肿瘤细胞来源、预测病情发展的阶段、提供个体化诊断和个体化治疗的依据。近几年发展起来的蛋白质芯片、纳米阵列免疫芯片以及飞行质谱等新技术(后基因——蛋白质组学技术)研究肿瘤时异常基因表达的众多蛋白质,可进一步揭示疾病的分子信息,将可为肿瘤学奠定新的分子基础。