2.1.2　实验设计

质量分数2%的稻秸作为底物，共接种物质量分数为8%（VS）。不同瘤胃菌群（RM）和厌氧污泥（AS）比设为1∶1、1∶2、2∶1、1∶0和0∶1（基于VS比），分别表示为I1、I2、I3、I4和I5。I1、I2、I3属于共接种体系，I4和I5分别属于瘤胃对照和厌氧污泥对照。

体系中添加营养元素满足微生物生长需要，包括NaCl（1.02g/L）、（NH₄）₂SO₄（0.26g/L）、CaCl₂·2H₂O（0.13g/L）、MgSO₄·7H₂O（0.20g/L）及体积分数为15%的无菌瘤胃上清液；添加强化产甲烷途径的金属辅因子，包括ZnSO₄·7H₂O（1.00mg/L）、CuSO₄·5H₂O（0.10mg/L）、FeSO₄·7H₂O（1.00mg/L）、NiSO₄·6H₂O（0.30mg/L）、CoCl₂·6H₂O（1.00mg/L）、NaMoO₄·2H₂O（0.10mg/L）、Na₂WO₄·2H₂O（0.20mg/L）。添加K₂HPO₄·3H₂O（1.34g/L）、KH₂PO₄（0.51g/L）和NaHCO₃（5.00g/L）组成缓冲体系，使初始pH维持在6.8～7.1之间。因为接种物没有经过脱气处理，每个体系设一个空白对照，只添加相同VS质量的接种物而不加稻秸底物，实验在39℃下厌氧发酵44d。

实验分别在两套装置上进行。产甲烷分析和微生物分析取样使用甲烷潜力测试系统（AMPTS，瑞典），如图2-1所示，有效体积250mL。而常规指标取样使用125mL血清瓶装置（80mL有效体积），在TS-2112B型大容量恒温摇床（上海天呈实验仪器，中国）上进行；每隔4d，每个体系取一瓶样品终止反应用于指标分析。在AMPTS系统中，产生的沼气通过4mol/L NaOH吸收后自动测量甲烷体积。每个体系甲烷体积要扣除相应空白对照数值。发酵结束后样品在离心力800g下离心15min，沉淀作为固相样品（IS），并通过SEM（FEI Quanta 200，荷兰）观察形态特征。上清液在离心力27000g下离心30min，沉淀作为液相样品（IL）[149]。两类样品储存在-20℃下用于DNA提取。

图2-1　甲烷潜力测试系统（AMPTS）示意图