二、新城疫

鸡新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性败血性传染病，俗称“鸡瘟”。即所谓亚洲鸡瘟。本病一年四季均可发生，尤以寒冷和气候多变季节多发。各种日龄的鸡均能感染，20～60日龄鸡最易感。主要特征是高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为和坏死。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病，我国将其列为一类动物疫病。

本病于1926年首次发现于印度尼西亚，同年发现于英国新城。Doyle（1927年）首次证实该病由病毒引起，病原与真性鸡瘟病原（禽流感病毒）不同，为了有别于真性鸡瘟，故以地名而命名为鸡新城疫，此后本病迅速向世界各地传播。我国新城疫的报道最早于1935年河南。梁英、马闻天等（1946）经病原分离证实为新城疫。20世纪50年代末于全国范围流行。虽然已经广泛接种疫苗预防，但该病仍不时在养禽业中造成巨大的损失，是最主要和最危险的禽病之一。

（一）病毒特征

新城疫病毒属于负链RNA目，副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒属（Avμlavirus）的副黏病毒I型（APMV-1）。新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜，病毒颗粒呈多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等。成熟的病毒粒子直径100～400nm。包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～15nm的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒中心是ssRNA分子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18nm。成熟的病毒以出芽方式释放至细胞外。

新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周，在－20℃中存放几个月或在－70℃中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8周之内，仍可在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒。病毒对乙醚敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。氢氧化钠等碱性物质对它的消毒效果不稳定。3%～5%来苏尔、酚和甲酚5min内可将裸露的病毒粒子灭活。在37℃的孵卵器内，用0.1%福尔马林熏蒸6h便可把它灭活。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳类动物的红细胞。大多数毒株能凝集公牛和绵羊的红细胞。在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞最为常用。该病毒可在9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养，大多数毒株也可在兔、猪、犊牛和猴的肾细胞以及鸡组织细胞等继代或传代细胞中培养。鸡胚的成纤维细胞、鸡胚和仓鼠的肾细胞常用于新城疫病毒的培养。

（二）临床症状

速发性嗜内脏型：也称Doyle氏型新城疫。发病突然，有时鸡只不表现任何症状而死亡。起初病鸡倦怠，呼吸增加，虚弱，死前衰竭（图1-7），4～8d内死亡。常见眼及喉部周围组织水肿，拉绿色、有时带血的稀粪。有幸存活下来的鸡，出现阵发性痉挛，肌肉震颤，颈部扭转，角弓反张。其他中枢神经表现为面部麻痹，偶尔翅膀麻痹。死亡率可达90%以上。

速发性嗜肺脑型：也称Beach氏型新城疫。表现为突然发病，传播迅速。可见明显的呼吸困难、咳嗽和气喘。有时能听到“咯咯”的喘鸣声，或突然的怪叫声，继之呈昏睡状态。食欲下降，不愿走动，垂头缩颈，产蛋量下降或停止。一两天内或稍后会出现神经症状，腿或翅膀麻痹和颈部扭转。在有些病例中，成年鸡死亡50%以上，常见的死亡率为10%；在未成年的小鸡中，死亡率高达90%；火鸡死亡率可达41.6%，而鹌鹑的死亡率仅达10%。

中发型新城疫：也称Beaudette氏型新城疫。主要表现为成年鸡的急性呼吸系统病状，以咳嗽为特征，但极少气喘。病鸡食欲下降，产蛋量降低并可能停止产蛋。中止产蛋可能延续1～3周，偶发病鸡不能恢复正常产量，蛋的质量受影响。

缓发型新城疫：也称Hitchner氏型新城疫。在成年鸡中症状可能不明显，可由毒力较弱的毒株所致，使鸡只呈现一种轻度的或无症状的呼吸道感染，各种年龄的鸡只很少死亡，但在小鸡并发其他传染病时，致死率可达30%。

我国根据临诊表现和病程长短把新城疫分为最急性、急性和慢性三个型：

最急性型：此型多见于雏鸡和流行初期。常突然发病，无特征性症状而迅速死亡。往往头天晚上饮食活动如常，翌晨发现死亡。

急性型：表现有呼吸道、消化道、生殖系统、神经系统异常。往往以呼吸道症状开始，继而下痢。起初体温升高达43～44℃，呼吸道症状表现咳嗽，黏液增多，呼吸困难而引颈张口、呼吸出声，鸡冠和肉髯呈暗红色或紫色。精神委顿，食欲减少或丧失，渴欲增加，羽毛松乱，不愿走动，垂头缩颈，翅翼下垂，鸡冠和肉髯呈紫色，眼半闭或全闭，状似昏睡。母鸡产蛋停止或软壳蛋。病鸡咳嗽，有黏性鼻液，呼吸困难，有时伸头、张口呼吸，发出“咯咯”的喘鸣声，或突然出现怪叫声。口角流出大量黏液，为排出黏液，常甩头或吞咽。嗉囊内积有液体状内容物，倒提时常从口角流出大量酸臭的暗灰色液体。排黄绿色或黄白色水样稀便（图1-8），有时混有少量血液。后期粪便呈蛋清样。部分病例出现神经症状，如翅、腿麻痹，站立不稳（图1-9），水禽、鸟等不能飞动、失去平衡等，最后体温下降，不久在昏迷中死去，死亡率达90%以上。1月龄内的雏禽病程短，症状不明显，死亡率高。

慢性型：多发生于流行后期的成年禽。耐过急性型的病禽，常为以神经症状为主，初期症状与急性型相似，不久有好转，但出现神经症状，如翅膀麻痹、跛行或站立不稳，头颈向后或向一侧扭转，常伏地旋转，反复发作。在间歇期内一切正常，貌似健康。但若受到惊扰刺激或抢食，则又突然发作，头颈屈仰，全身抽搐旋转，数分钟又恢复正常。最后可变为瘫痪或半瘫痪，或者逐渐消瘦，终至死亡，但病死率较低。

（三）病理变化

剖检可见以各处黏膜和浆膜出血，特别是腺胃乳头和贲门部出血（图1-10）。心包、气管、喉头、肠和肠系膜充血或出血（图1-11）。直肠和泄殖腔黏膜出血。卵巢坏死、出血，卵泡破裂性腹膜炎等。消化道淋巴滤泡的肿大出血和溃疡是ND的一个突出特征。消化道出血病变主要分布于：腺胃前部—食道移行部；腺胃后部—肌胃移行部；十二指肠起始部；十二指肠后段向前2～3cm处；小肠游离部前半部第一段下1/3处；小肠游离部前半部第二段上1/3处；梅尼厄氏憩室（卵黄蒂）附近处；小肠游离部后半部第一段中间部分；回肠中部（两盲肠夹合部）；盲肠扁桃体，在左右回盲口各一处，枣核样隆起，出血（而不是充血），坏死。

非典型新城疫剖检可见气管轻度充血，有少量黏液。鼻腔有卡他性渗出物。气囊混浊。少见腺胃乳头出血等典型病变。

（四）流行病学特征

新城疫病毒可经过消化道或呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体，病毒24h内在侵入部位繁殖，随后进入血液扩散到全身，引起病毒血症。此时病毒吸附在细胞上，使红细胞凝集、膨胀，继而发生溶血。同时病毒还使心脏、血管系统发生严重损害，导致心肌变性而发生心脏衰竭，从而引起血液循环高度障碍。由于毛细血管通透性坏死性炎症，因而临诊上表现严重的消化障碍和下痢。在呼吸道则主要发生卡他性炎症和出血，使气管被渗出的黏液堵塞，造成高度呼吸困难。在病的后期，病毒侵入中枢神经系统，常引起非化脓性脑炎变化，导致神经症状。

鸡、野鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹑易感。其中以鸡最易感，野鸡次之。不同年龄的鸡易感性存在差异，幼雏和中雏易感性最高，两年以上的老鸡易感性较低。水禽如鸭、鹅等也能感染本病，并已从鸭、鹅、天鹅、塘鹅和鸬鹚中分离到病毒，但它们一般不能将病毒传给家禽。鸽、斑鸠、乌鸦、麻雀、八哥、老鹰、燕子以及其他自由飞翔或笼养的鸟类，大部分也能自然感染本病或伴有临诊症状或取隐性经过。历史上有好几个国家因进口观赏鸟类而招致了本病的流行。

病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24h，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。

病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4～5d内波及全群。

（五）预防及治疗

对于本病的预防要加强鸡群的饲养管理工作，包括建立一套科学合理的鸡舍通风系统，减少对鸡群的应激等；加强鸡场的生物安全措施，包括一系列消毒隔离措施等；通过免疫接种增强鸡群对新城疫的抵抗力。

要做好免疫，新城疫的免疫原则如下：

（1）及早实施免疫，提前建立局部黏膜抵抗力。

（2）活疫苗与灭活苗联合使用。活疫苗免疫后产生免疫应答早、免疫力完全，缺点是产生的体液抗体低且维持时间短。灭活苗免疫能诱导机体产生坚强而持久的体液抗体，但产生免疫应答晚，且不能产生局部黏膜抗体。两种疫苗联合使用可以做到优势互补，给鸡群提供坚强且持久的保护。

（3）根据抗体水平，及时补充免疫。当前主要以非典型新城疫发生为主，原因是鸡群抗体不均匀有效，因而监测鸡群的抗体水平非常重要，要保证HI抗体水平育成期不低于6，蛋鸡不低于9。

建议的免疫程序如下。

首免：1～3日龄，Ⅱ系、Ⅳ系或克隆株疫苗。

二免：首免后1～2周，VH、Ⅳ系或克隆株。

三免：二免后2～3周，活苗+灭活苗。

四免：8～10周龄，Ⅳ系或克隆株气雾免疫或点眼。

五免：16～18周龄，活苗+灭活苗。

产蛋期：根据抗体水平及时补免或两个月免疫1次活疫苗。在做好免疫的同时，加强饲养管理，做好消毒工作。

存在本病或受本病威胁的地区，预防的关键是对健康鸡进行定期免疫接种。平时应严格执行防疫规定，防止病毒或传染源与易感鸡群接触。

发生本病时应按《动物防疫法》及其有关规定处理。扑杀病禽和同群禽，深埋或焚烧尸体；污染物要无害化处理；对受污染的用具、物品和环境要彻底消毒。对疫区、受威胁区的健康鸡立即紧急接种疫苗。

鸡新城疫的危害性极大，所以一旦发现要及早进行治疗，直到完全治愈，恢复好再将鸡回群。另外对于没有治疗价值或已经病死的鸡要进行深埋或者焚烧，受到污染的用具和物品要彻底消毒，避免对其他鸡群造成伤害。

新城疫突发病鸡的治疗：

对于突然发病，只是单纯新城疫感染的鸡群，先免疫后用药物。

新城疫四系苗4倍量（最后一次新城疫免疫剂量+2个剂量）+植物血凝素800只/瓶集中饮水1次。板青毒克每瓶150kg水，杆必治每袋150kg水，配合，在免疫24h后，开始投服，上下午集中两次饮水，连用3d。

对新城疫混合感染病鸡的治疗：

不能排除混合感染的情况，特别是混合有流感。应先用药，后用苗。

败毒金刚每瓶150kg水，杆必治每袋150kg水，配合，上下午集中两次饮水，连用3d。间隔24h后酌情免疫。新城疫四系苗4倍量（最后一次新城疫免疫剂量+2个剂量）+植物血凝素800只/瓶集中饮水1次。

新城疫继发大肠杆菌病鸡的治疗：

新城疫继发大肠杆菌病比较常见，以肉鸡最为严重。

芪林双星每瓶150kg水，杆菌先锋每袋150kg水，配合集中饮水，连用3d。

鸡新城疫中药治疗方法：

生石膏1200g，生地黄300g，水牛角600g，黄连200g，栀子300g，丹皮200g，黄芩250g，赤芍250g，玄参 250g，知母300g，连翘300g，桔梗250g，甘草150g，淡竹叶250g，地龙200g，细辛5g，干姜10g，板蓝根150g，青黛100g，共同粉碎，0.5%～1%拌料或煲水，药液饮水，药渣拌料。

（六）实验室检测

依据标准：GB/T 16550—2008。

1.范围

本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝试验、血凝抑制试验、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和综合判定。

2.缩略语

下列缩略语适用于本标准。

DEPC——焦炭酸二乙酯。

HA——血凝。

HAU——血凝单位，以完全凝集病毒的血清最高稀释倍数为一个血凝单位。

HI——血凝抑制。

ICPI——脑内接种致病指数。

IVPI——静脉接种致病指数。

MDT——致死鸡胚平均死亡时间。

NDV——新城疫病毒。

SPF——无特定病原体。

3.病毒分离与鉴定

（1）病毒分离

1）样品采集　从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子，后者需带有可见粪便，对雏禽采集拭子容易造成损伤，可采集新鲜粪便代替。死禽以脑、肺脏、脾脏为主，也可采集其他病变组织。

2）样品处理　样品置于含抗生素的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.0～7.4），抗生素视条件而定，在组织和气管拭子保存液中应含青霉素（2000UI/ml）、链霉素（2mg/ml）、卡那霉素（50μl/ml）和制霉菌素（1000UI/ml），而粪便和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后调pH值到7.0～7.4。粪便和搅碎的组织，应和含抗生素的PBS溶液制成10～20g/100ml的悬浮液，在室温下静置1～2h。将粪便或组织的悬浮液在4℃下以3000g离心5min，取上清液进行鸡胚接种。

3）鸡胚接种　用1ml注射器吸取上清液，按每枚0.2ml，经尿囊腔接种至少5个9～11日龄的SPF鸡胚，接种后，35～37℃孵育4～7d，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。

4）病毒收获　18h以后死亡和濒死的以及结束孵化后时存活的鸡胚置4℃冰箱4～24h，无菌采集尿囊液。

（2）病毒鉴定

1）血凝试验　对于血凝试验呈阳性的样品采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离的尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒阴性。

2）血凝抑制试验　采用新城疫标准阳性血清进行血凝抑制试验，确认是否有新城疫病毒繁殖。

（3）致病指数测定　经确定存在新城疫病毒繁殖的情况下，应根据下列指标之一进行毒力判定：

1）病毒致死鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定：

① 将新鲜的感染尿囊液用灭菌的生理盐水连续10倍稀释成10－6～10－9 ；

② 每个稀释度经尿囊腔接种5个9～10日龄的SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，置于37℃培养；

③ 余下的病毒稀释液于4℃保存，8h后，每个稀释度接种另外5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，置37℃培养；

④ 每日照蛋两次，连续观察7d，记录各鸡胚的死亡时间；

⑤ 最小致死量是指能引起所有用此稀释度接种的鸡胚死亡的最大稀释度；

⑥ MDT是指最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间（h），计算方法见式（1-1）。

MDT=　　 （1-1）

式中　NX——Xh内死亡的胚胎数；

　　　NY——Yh内死亡的胚胎数；

　　　X，Y——胚胎死亡时间，单位为h；

　　　T——死亡的胚胎总数。

2）接种致病指数（ICPI）测定：

① HA滴度高于4log2（大于1/16）以上新鲜感染尿囊液（24～48h，细菌检验为阴性），用无菌等渗盐水作10倍稀释；

② 脑内接种出壳24～48h之间的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种0.05ml；

③ 每24h观察1次，共观察8d；

④ 每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死鸡记作2（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记2）；

⑤ ICPI是每只鸡8d内所有每次观察的平均数，计算方法见式（1-2）。

ICPI=　　 （1-2）

式中　∑s——8d累计发病数；

　　　∑d——8d累计死亡数；

　　　T——8d累计观察鸡的总数。

3）接种致病指数（IVPI）测定：

① HA滴度高于4log2（大于1/16）以上新鲜感染尿囊液（24～48h，细菌检验为阴性），用无菌等渗盐水作10倍稀释；

② 静脉接种6周龄的SPF小鸡，接种10只，每只接种0.1ml；

③ 每天观察1次，共10d，每次观察要计分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡或出现其他神经症状记作2，死亡鸡记作3（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作3）；

④ IVPI是指每只鸡10d内所有每次观察数值的平均值，计算方法见（1-3）。

IVPI=　　 （1-3）

式中　∑s——10d累计发病数；

　　　∑p——10d累计瘫痪数；

　　　∑d——10d累计死亡数；

　　　T——10d累计观察鸡的总数。

（4）结果判定　结果判定细则如下：

1）MDT低于60h为强毒性NDV，MDT在60～90h为中等毒力型NDV，MDT大于90h为低毒力NDV；

2）ICPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株毒力的ICPI为0；

3）IVPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的IVPI接近3.0，而弱毒株的IVPI为0。

4.血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验

（1）原理　新城疫病毒表面的血凝素能与豚鼠和鸡的红细胞表面的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。

（2）适用范围　主要用于检测新城疫免疫动物血清抗体效价。

（3）试验材料

1）96孔110°V形血凝板

2）微量移液器（50μl、25μl）带滴头

3）微量振荡器

4）新城疫病毒血凝素分型抗原和标准分型阳性血清

5）1%SPF鸡或新城疫抗体阴性鸡红细胞悬液（配制方法见附录A）

6）pH7.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（配制方法见附录B）

（4）HA试验方法

1）在微量反应板的1～12孔均加入0.025ml PBS，换滴头。

2）吸取0.025ml病毒悬液加入第1孔，混匀。

3）从第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之，换滴头。

4）每孔再加入0.025ml PBS。

5）每孔均加入0.025ml 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

6）振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1h）。对照孔红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。

7）结果判定　将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见表1-3）。

能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（－），否则此次检验无效。

（5）HI试验方法

1）根据（4）的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64（256除以4）。

2）在微量反应板的1～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。

3）吸取0.025ml血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025ml于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。

4）1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025ml，室温（约20℃）静置至少30min。

5）每孔加入0.025ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，振荡混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底。

6）结果判定　以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于5log2为阳性。

5.反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

（1）仪器设备　所用仪器设备如下：

1）PCR仪；

2）高速台式冷冻离心机：最大离心力12000g以上；

3）生物安全柜；

4）冰箱；

5）水浴锅；

6）微量移液器；

7）组织匀浆器；

8）电泳仪；

9）电泳槽；

10）紫外凝胶成像仪。

（2）试剂　所用试剂如下：

1）RNA提取试剂Trizol；

2）三氯甲烷；

3）异丙醇；

4）75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，－20℃预冷。

（3）操作程序

1）样品的采集和处理　取200μl离心后的上清提取RNA。也可选择含病毒的鸡胚尿囊液进行RT-PCR鉴定。

2）病毒核酸RNA的提取　RNA核酸的提取应在样品制备区。应保证无菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。提取RNA时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。

用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下（样品以鸡胚尿囊液为例）：

① 在无RNA酶的1.5ml离心管中加入200μl尿囊液后，加入1ml Trizol，振荡20s，室温静置10min；

② 加入200μl三氯甲烷，颠倒混匀，室温静置10min，以12000r/min离心15min；

③ 管内液体分为三层，取500μl上清液于离心管中，加入500μl预冷（－20℃）的异丙醇，颠倒混匀，静置10min，以12000r/min离心15min，沉淀RNA，弃去所有液体（离心管在吸水纸上控干）；

④ 加入700μl预冷（－20℃）的75%乙醇洗涤，倾倒混匀2～3次，以12000r/min离心10min；

⑤ 调水浴至60℃，室温下干燥10min；

⑥ 加入40μl DEPC水，60℃作用10min，充分溶解RNA，－70℃保存或立即使用。

3）配置RT-PCR反应体系　在样品处理区内由专人按表1-4给出的程序分步进行。注意只能在试剂准备区打开和配制试剂，配制完毕后应及时将剩余试剂放回贮存区域。将适量的核酸样品小心加入装有反应液体的反应管内，盖紧盖子做好标记。参照表1-4反应体系配置RT-PCR扩增。

4）RT-PCR　按照表1-4中的加样顺序全部加完后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入一滴液体石蜡（约20μl）。同时设立阳性对照和阴性对照。

循环条件为：

① 第一阶段，反转录42℃/45min；

② 第二阶段，预变性95℃/3min

③ 第三阶段，94℃/30s，55℃/30s，72℃/45s，30个循环；

④ 第四阶段，72℃/7min。

最后的RT-PCR产物置4℃保存。

5）电泳　操作程序如下：

① 制备1.5%琼脂糖凝胶板；

② 取5μl PCR产物与0.5μl加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中；

③ 加入DNA分子质量标准物；

④ 盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，30～40min；

⑤ 紫外线灯下观察结果，凝胶成像仪扫描图片存档，打印；

⑥ 用分子质量标准物比较判断PCR片段大小。

（4）结果判定　结果判定细则如下：

1）出现0.5kb大小左右的目的片段（与阳性对照大小相符，琼脂糖浓度1.5%，标准物质Marker为DL2000），而阴性对照无目的片段出现方可判为新城疫病毒阳性；

2）对于扩增到的目的片段，需进一步进行序列测定，从分子水平确定其致病性强弱。

3）根据序列测定结果，对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分析，如果毒株F2蛋白的C端有“多个碱性氨基酸残基”，F1蛋白的N端即117位为苯丙氨酸，可确定为新城疫强毒感染。“多个碱性氨基酸”指在113位到116位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸。

附录 A

（资料性附录）

1%鸡红细胞悬液制备

采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3～4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5～10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3次（洗净血浆和白细胞），最后吸取压积红细胞，用PBS配成体积分数为1%的悬液，于4℃保存备用。

附录B

（资料性附录）

pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）配制

氯化钠（NaCl）　　　　　　　 　　　8.0g

氯化钾（KCl）　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4）　　　  　　　1.44g

磷酸二氢钠（NaH2PO4）　　　　   　　0.24g

加蒸馏水至1000ml

将上述成分依次溶解，用盐酸调至pH7.2，分装，121℃、15min高压灭菌。