五、猪轮状病毒病

猪轮状病毒病，是由猪轮状病毒引起的猪急性肠道传染病，主要症状为厌食、呕吐、下痢，中猪和大猪为隐性感染，没有症状。病原体除猪轮状病毒外，从犊牛、羔羊、马驹分离的轮状病毒也可感染仔猪引起不同程度的症状。轮状病毒对外界环境的抵抗力较强，在18～20℃的粪便和乳汁中，能存活7～9个月。

（一）病毒特征

猪轮状病毒（rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的A、B、C、E群。成熟完整的病毒粒子呈圆形，没有囊膜，具有双层表壳，直径为65～75nm的十二面体对称。电镜观察，病毒的中央为一个电子致密的六角形棱心，直径37～40nm，即芯髓；周围有一电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成中间层衣壳；外周为一层光滑薄膜构成的外层衣壳，厚约20nm，形成一个轮状结构，RV由此而得名。在感染的粪样和细胞培养物中均存在两种形式的病毒粒子：具有双层表壳的光滑型（S型）双层颗粒，有感染性，直径为75nm；没有外表壳的粗糙型（R型）单壳颗粒，无感染性，直径为65nm。

RV对理化因素作用具有较强的抵抗力，所以清洗和消毒猪舍时必须注意此特点。它耐乙醚、氯仿、去氧胆碱钠、次氯酸盐；反复冻融，声波处理，以及37℃下1h仍不失活；pH3.5～10范围内病毒保持感染力，对胰蛋白酶稳定，粪便中的RV在18～20℃室温中经7个月仍有感染性；氯、臭氧、碘、酚等可灭活病毒。

（二）临床症状

潜伏期一般为12～24h，常呈地方性流行。初精神沉郁，食欲不振，不愿走动，有些吃奶后发生呕吐，继而腹泻，粪便呈黄色、灰色或黑色，为水样或糊状。症状的轻重决定于发病的日龄、免疫状态和环境条件，缺乏母源抗体保护的出生后几天的仔猪症状最重，环境温度下降或继发大肠杆菌病时，常使症状加重，病死率增高。通常10～21日龄仔猪的症状较轻，腹泻数日即可康复，3～8周龄仔猪症状更轻，成年猪为隐性感染。

（三）病理变化

病理变化病变主要在消化道，胃壁弛缓，充满凝乳块和乳汁，肠管变薄，小肠壁薄呈半透明，内容物为液状，呈灰黄色或灰黑色，小肠绒毛缩短，有时小肠出血，肠系淋巴结肿大。

（四）流行病学特点

轮状病毒主要存在于病猪及带毒猪的消化道，随粪便排到外界环境后，污染饲料、饮水、垫草及土壤等，经消化道途径使易感猪感染。排毒时间可持续数天，可严重污染环境，加之病毒对外界环境有顽强的抵抗力，使轮状病毒在成猪、中猪之间反复循环感染，长期扎根猪场。另外，人和其他动物也可散播传染。本病感染没有明显的季节性，高峰在晚秋及冬季，一些地区季节性不明显而呈终年流行，散发，偶见暴发。一旦发生本病，随后将每年连续发生，因为RV在体外具有较强的抵抗力，且阴性感染的成年动物不断向外排毒。各种年龄的猪都可感染，在流行地区由于大多数成年猪都已感染而获得免疫。因此，发病猪多是8周龄以下的仔猪，日龄越小的仔猪，发病率越高，发病率一般为50%～80%，病死率一般为10%以内。自然情况下，多发于2～56日龄的猪，成年猪感染不会发生严重的临床症状。有实验表明RV检出率最高的仔猪周龄为2～8周龄，检出率峰值为8周龄仔猪。仔猪体内排出RV峰值是3～4周龄。

（五）预防及治疗

治疗：无特效治疗药物。发现立即停止喂乳，以葡萄盐水或复方葡萄糖溶液（葡萄糖43.20g，氯化钠9.20g，甘氨酸6.60g，柠檬酸0.52g，柠檬酸钾0.13g，无水磷酸钾4.35g，溶于2L水中即成）给病猪自由饮用。同时，进行对症治疗，如投用收敛止泻剂，使用抗菌药物，以防止继发细菌性感染。一般都可获得良好的效果。

预防：主要依靠加强饲养管理，认真执行一般的兽医防疫措施，增强猪的抵抗力。在流行地区，可用猪轮状病毒油佐剂灭活苗或猪轮状病毒弱毒双价苗对母猪或仔猪进行预防注射。油佐剂苗于怀孕母猪临产前30d，肌内注射2ml；仔猪于7日龄和21日龄各注射1次，注射部位在后海穴（尾根和肛门之间凹窝处）皮下，每次每头注射0.5ml。弱毒苗于临产前5周和2周分别肌内注射1次，每次每头1ml。同时要使新生仔猪早吃初乳，接受母源抗体的保护，以减少发病和减弱病症。

（六）实验室检测

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法。

参照标准：GB/T 36871—2018。

1.试剂和仪器设备

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器分装。

（1）仪器　生物安全柜、高速冷冻离心机、组织匀浆器或研钵、PCR仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、紫外透射仪、2～8℃冰箱、－20℃冰箱、单道移液器（0.5～10μl、10～50μl、20～200μl、100～1000μl等规格）。

（2）试剂　氯仿（常温保存）、PBS（见附录A、常温保存）、1×TAE（见附录A、常温保存）、Trizol（4～8℃保存）、异丙醇（4～8℃保存）、DNA分子量标准（4～8℃保存）、DEPC处理水（见附录A、4～8℃保存）、阳性对照（PEDV、TGEV和PoRV分别经Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞传代，病毒含量分别为25TCID50/ml、50TCID50/ml、50TCID50/ml、－20℃保存）、阴性对照（Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞悬液、－20℃保存）、RNA反转录试剂盒（－20℃保存）、多重RT-PCR方法中使用的各种引物对（见附录B，引物干粉及稀释引物保存于－20℃）。

（3）耗材　Eppendorf管（EP管）、PCR管、吸头。

2.样品的采集、处理及运输

（1）样品的采集和处理

1）生物安全及采样要求

① 生物安全要求。样品采集及处理过程中应戴一次性手套、口罩、防护服。

② 采样要求。应采集出现腹泻症状12～24h内猪的粪便、肛门拭子样品或解剖猪的小肠；母猪可采集乳汁（初乳最佳）。采集母猪乳汁前要对乳房外表进行消毒；采集病变小肠时，先结扎拟采集肠道区域两端后，再剪取该组织（防止肠内容物流出），将其全部放入样品袋内。每个样品要单独采集和分装，避免交叉污染，样品避免接触甲醛或高温，以免降低检出率。

2）粪便样品　用洁净的药匙和其他物品，刮取适量的新鲜粪便放置于EP管或其他洁净容器中。

3）肛门拭子样品

① 采集方法。将灭菌的医用棉签插入肛门（以棉签棉花部分全部插入肛门为准），同一方向转动3次，确保充分获取粪便。

② 样品处理。将肛门拭子放在盛有0.8ml灭菌PBS的无菌EP管中，涡旋振荡10min，反复冻融2次，4℃条件下14600g离心10min，取上清转入新的EP管中，编号备用。

4）肠道样品

① 采集方法。选择充血、出血、肠壁变薄、含多量水样粪便等病变明显的小肠组织。提取模板前，用无菌剪刀剪取约0.5cm×0.5cm，作为待检样品。

② 样品处理。加入0.8～1.0ml PBS混匀，组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，将组织悬液转入无菌EP管中，反复冻融2次，4℃条件下14600g离心10min，取上清转入新的EP管中，编号备用。

5）母猪乳汁

① 采集方法。用无菌EP管收集母猪产后乳汁2.0～3.0ml。

② 样品处理。将乳汁转入无菌EP管中，反复冻融2次，4℃条件下14600g离心10min，取上清转入新的EP管中，编号备用。

（2）存放及运输　采集样品与冰块或干冰一起放入保温壶或保温箱，密封，在保温壶和保温箱外喷洒来苏尔或季铵盐类消毒液，尽快送到实验室检测。采集或处理样品在4～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置于－80℃冰箱，避免反复冻融。

3.操作方法

（1）样品RNA的制备（Trizol法或RNA提取试剂盒）

1）取1.5ml灭菌EP管，分别加入待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品各200μl，加入1ml Trizol溶液，剧烈振荡，静置5min。

2）加入200μl氯仿，振荡，冰上静置7min。

3）4℃条件下14600g离心10min，取上清600μl，加入等体积异丙醇混匀后，冰上静置10min。4℃条件下14600g离心7min，弃上清，加入800μl 75%的冷乙醇，9800g离心5min。

4）弃上清，自然干燥5min，加入20μl DEPC处理水溶解沉淀，即为RNA模板。

（2）反转录（cDNA的合成）　配制反转录反应体系，每管加入（1）、4）中制备的RNA模板16μl和4μl 5×RNA反转录反应混合液（含Buffer、dNTP、M-MLV、RNA酶抑制剂、通用反转录引物等），37℃水浴15min或置于PCR仪中37℃15min，反应结束后，经85℃15s灭活反转录酶，即为cDNA，直接用于PCR扩增或－20℃冻存备用。

（3）多重PCR扩增　PCR扩增体系配制见表1-12。引物工作浓度均为10μmol/L，各种试剂加完后充分混匀，瞬时离心，使反应液全部集中于孔底。

PCR扩增条件：94℃预变性5min后，94℃50s，55℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，扩增反应结束后取出产物置于4～8℃。

（4）扩增产物的电泳检测

1）取适量的琼脂糖配制浓度为1.5%的琼脂糖溶液，充分溶化后按1∶10000加入溴化乙锭或新型核酸染料，倒入胶槽制备凝胶板。

2）在电泳槽中加入1×TAE，使液面没过凝胶。取8μl扩增产物加入各凝胶孔；取5μl DNA分子量标准物（DL2000 Marker）加到另一凝胶孔中。

3）电泳，待染料移行到凝胶4/5距离，停止电泳。

4）将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察，判定结果并做好记录。

4.结果判定

（1）试验成立条件　含PEDV、TGEV和PoRV阳性对照材料，PCR扩增产物电泳后，同时出现大小约663bp、528bp和333bp的特异性条带，阴性对照材料无任何扩增产物，则试验结果成立；缺少任何一条扩增产物或大小不符，则试验不成立。

（2）结果判定

1）检测结果分类　在试验成立的前提下，被检样品中可出现PEDV、TGEV和PoRV等3种病原的三重感染、二重感染、单独感染和不感染的结果。

2）阳性结果

① 出现大小约为663bp、528bp和333bp的3条特异性条带，判为PEDV、TGEV和PoRV三重感染阳性。

② 二重感染。出现大小约为663bp和528bp的特异性条带，判定为PEDV和TGEV二重感染阳性；出现大小约为663bp和333bp的特异性条带，判定为PEDV和PoRV二重感染阳性；出现大小约为528bp和333bp的特异性条带，判定为TGEV和PoRV二重感染阳性。

③ 单独感染。仅出现大小约为663bp或528bp或333bp的特异性条带，判定为PEDV或TGEV或PoRV单独感染阳性。

④ 阴性结果。未出现大小约为663bp、528bp和333bp的特异性条带，判定为PEDV、TGEV和PoRV阴性。

附录A

（规范性附录）

试验试剂和溶液的配制

A.1　0.01mol/L（pH7.2）PBS

NaCl　　　　　　　  　8.0g

KH2PO4　　 　　　　　0.2g

Na2HPO4　　 　　 　 　2.9g

KCl　　                    　　0.2g

加蒸馏水至1000ml，调pH值至7.2～7.4， 121℃高压灭菌30min。

A.2　1×TAE

Tris碱　　　　　　　　　　　　　　 　24.2g

冰乙酸　　　　　　　　　　　　　　　5.7ml

0.5mol/L EDTA（pH8.0）　　　　　　   10.0ml

加蒸馏水至100ml，使用时用蒸馏水作50倍稀释。

A.3　DEPC处理水

用0.1%DEPC处理后的蒸馏水，经121℃高压灭菌30min。

附录B

（规范性附录）

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR引物序列（表1-13）。