二、非洲猪瘟

非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热（达40～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或黏液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。

本病自1921年在肯尼亚首次被报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流行至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙、西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。

2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近，仅为1000km左右；另外，我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位，每年种猪及猪肉制品进口总量巨大，与多个国家贸易频繁；而且，我国与其他国家的旅客往来频繁，旅客携带的商品数量多、种类杂。因此，非洲猪瘟传入我国的风险日益加大。一旦传入，其带来的直接和间接损失将不可估量。对此，2017 年 4 月 12 日，我国农业农村部发布了关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知。

2020年2月6日，希腊农业发展和食品部宣布，该国东北部塞雷斯地区一家小型养猪场发生非洲猪瘟，这是希腊报告的首起非洲猪瘟疫情。

2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟。2018年12月20日，非洲猪瘟当选为2018年度社会生活类十大流行语。韩国农林畜产食品部2019年9月17日发布消息说，京畿道坡州市一家养猪场16日下午报告5头猪死亡，检疫部门17日早晨6时30分确认死亡病猪感染非洲猪瘟。

（一）病毒特征

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175～215nm，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170～190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞质中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。

本病毒在被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，加热被病毒感染的血液55℃ 30min或60℃ 10min，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。

（二）临床症状

自然感染的潜伏期差异很大，短的4～8d，长的15～19d；人工感染为2～5d。潜伏期的长短与接毒剂量和接毒途径有关。根据病毒的毒力和感染途径不同，ASF可表现为最急性型、急性型和亚急性型或慢性型等不同的类型。

最急性型：由非洲古典型毒株引起，突然体温升高，未见任何症状和病变而死亡。

急性型：流行开始多为急性型，以食欲废绝、高热（部分病猪、幼龄猪多为间歇热）、白细胞减少（下降至正常的40%～50%）、血小板及淋巴细胞明显减少、内脏器官出血、皮肤出血或发绀（尤其是耳、鼻、尾、外阴和腹部等无毛或少毛处）和病死率高为特征。体温升高至41～42℃，稽留4d，当体温下降或死前1～2d病猪才出现临诊症状，表现精神沉郁、厌食，喜卧，呼吸、心跳加快，腹泻、粪便带血，行走时后躯无力，眼、鼻有浆液性或黏液性分泌物，鼻端、耳、腹部等处的皮肤发绀。怀孕母猪可发生流产。病程6～13d，长的达20多天，病死率95%左右，幸存者将终生带毒。

亚急性型或慢性型：由欧洲新型毒株引起，或发生在已接种过弱毒疫苗的猪。症状较轻，病程较长，发病后15～45d死亡，病死率30%～70%。亚急性型表现为暂时性血小板和白细胞减少，并可见大量出血灶。慢性型表现以不规则波浪热、呼吸道疾病、流产和低病死率为特征，只呈现慢性肺炎症状，咳嗽、气喘、消瘦、生长停滞。有些慢性型还可见皮肤坏死、溃疡、斑块，耳、关节、尾、鼻、唇可见坏死性溃疡脱落；关节呈无痛性肿胀。病程可持续数月，病死率低。

（三）病理变化

在耳、鼻、腋下、腹、会阴、尾、脚无毛部分呈界线明显的紫色斑，耳朵紫斑部分常肿胀，中心深暗色分散性出血，边缘褪色，尤其在腿及腹壁皮肤肉眼可见到。显微镜所见，于真皮内小血管，尤其在乳头状真皮呈严重的充血和肉眼可见的紫色斑，血管内发生纤维性血栓，血管周围有许多嗜酸球，耳朵紫斑部分上皮之基层组织内，可见到血管血栓性小坏死现象。切开胸腹腔，心包、胸膜、腹膜上有许多澄清、黄或带血色液体，尤其在腹部内脏或肠系膜上表部分，小血管受到影响更甚。于内脏浆液膜可见到棕色转变成浅红色之瘀斑，即所谓的麸斑（BranFlecks），尤其于小肠更多，直肠壁深处有暗色出血现象，肾脏有弥漫性出血情形，胸膜下水肿特别明显，及心包出血。

（1）在淋巴结有猪瘟罕见的某种程度的出血现象，上表或切面似血肿之结节较淋巴结多。

（2）脾脏肿大，髓质肿胀区呈深紫黑色，切面突起，淋巴滤泡小而少，有7%猪脾脏发生小而暗红色突起的三角形栓塞情形。

（3）循环系统　心包液特别多，少数病例中呈混浊且含有纤维蛋白，但多数心包下及次心内膜充血。

（4）呼吸系统　喉、会厌部有瘀斑充血及扩散性出血，比猪瘟更甚，瘀斑有的发生于气管前三分之一处；镜检下，肠有充血而没有出血病灶，肺泡则呈现出血现象，淋巴球呈破裂状。

（5）肝　肉眼检查显正常，呈血暗色或斑点大多异常，近胆部分组织有充血及水肿现象，小叶间结缔组织有淋巴细胞、浆细胞及间质细胞浸润，同时淋巴球的核破裂为其特征。

（四）流行病学特征

ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在出现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40%～85%之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90%～100%；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20%～40%之间，在幼年动物的死亡率在70%～80%之间；低致病性毒株死亡率在10%～30%之间。

易感动物：猪与野猪对本病毒都系自然易感性，各品种及各不同年龄之猪群同样是易感性。

传播媒介：非洲和西班牙半岛有几种软蜱是ASFV的储藏宿主和媒介。美洲等地分布广泛的很多其他蜱种也可传播ASFV。一般认为，ASFV传入无病地区都与来自国际机场和港口的未经煮过的感染猪制品或残羹喂猪有关，或由于接触了感染家猪的污染物，胎儿、粪便、病猪组织，并喂了污染饲料而发生。

通常非洲猪瘟跨国境传入的途径主要有四类：一是生猪及其产品国际贸易和走私，二是国际旅客携带的猪肉及其产品，三是国际运输工具上的餐厨剩余物，四是野猪迁徙。

中国已查明疫源的68起家猪疫情，传播途径主要有三种：一是生猪及其产品跨区域调运，约占全部疫情19%；二是餐厨剩余物喂猪，约占全部疫情34%；三是人员与车辆带毒传播，这是当前疫情扩散的最主要方式，约占全部疫情46%。

（五）预防及治疗

目前针对本病无特效药物，无疫苗预防，但高温、消毒剂可以有效杀灭病毒，所以做好养殖场生物安全防护是防控非洲猪瘟的关键。

一是严格控制人员、车辆和易感动物进入养殖场；进出养殖场及其生产区的人员、车辆、物品要严格落实消毒等措施。

二是尽可能封闭饲养生猪，采取隔离防护措施，尽量避免与野猪、钝缘软蜱接触。

三是严禁使用泔水或餐余垃圾饲喂生猪。

四是积极配合当地动物疫病预防控制机构开展疫病监测排查，特别是发生猪瘟疫苗免疫失败、不明原因死亡等现象，应及时上报当地兽医部门。

（六）实验室检测

依据标准：GB/T 18648—2002。

1.PCR试验

（1）材料准备

1）样品DNA制备方法见附录A（标准的附录）。

2）电泳缓冲液的配制方法见附录B。

3）标准ASFV-BA71株DNA、引物1、引物2、1.25mmol/L dNTP和载样缓冲液。

4）Taq DNA聚合酶、100碱基对（bp）Ladder（标准DNA Marker）、10倍浓度的聚合酶链式反应扩增缓冲液。

5）自动DNA热循环仪。

（2）操作方法

1）将下列试剂按要求量加入0.75ml的离心管中：灭菌蒸馏水（24.5μl）；10倍浓缩的PCR扩增缓冲液（5μl）；1.25mmol/L dNTP贮存液（8μl）；引物1（1μl）；引物2（1μl）；样品DNA溶液（10μl）（见附录A）；Taq DNA聚合酶（0.5μl）。

2）设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA17株10μl，DNA含量为10fg；阴性对照为不含DNA的灭菌蒸馏水10μl。

3）取50μl矿物油覆盖在混合液上。

4）将加有样品或对照混合物的Eppendorf管放入自动DNA热循环仪中，按下列程序和条件进行扩增：94℃5min，50℃2min，72℃3min循环一次；94℃1min，50℃2min，72℃3min循环30次；94℃1min，50℃2min，72℃10min循环1次，最后置于4℃保存。

5）上述步骤完成后，从矿物油下取出每种反应混合物20μl，放入另一只干净的Eppendorf管中并加2μl载样缓冲液。

6）将所有样品按编号加入对应的2%琼脂糖凝胶（见附录B）板的各孔中，其中一孔加标准阳性DNA样品，在凝胶的孔中加入标准分子量DNA Marker。

7）将凝胶在150V恒定电压下电泳2h。

8）结果判定：用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物同步迁移的带，分子量265bp。阴性对照和非ASF感染猪无265bp带。

2.酶联免疫吸附试验（ELISA）

（1）试剂　标准抗原

（2）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（配制方法见附录C），底物溶液（见附录C）。

（3）操作方法

1）取ELISA微量滴定板，每孔加入0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液稀释至工作滴定的抗原溶液50μl，封板后4℃作用16h（过夜）。

2）用pH7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗板3洗，每次2min。

3）用含0.05%吐温-20的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，将待检血清及阳性和阴性对照血清做30倍稀释，将稀释的血清加入用抗原包被的孔中，每孔中加50μl。

4）将滴定板放在微量振荡器上，37℃作用30min，然后用0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗板3次。

5）每孔加入50μl用含0.05%吐温-20的0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制的免疫球蛋白G（IgG）-抗猪过氧化物酶结合物溶液。

6）将滴定板放入振荡器，37℃作用1h，然后用0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗3次。

7）每孔加50μl底物溶液。

8）室温下显色15min。

9）每孔加50μl、1mol/L的硫酸终止反应。

10）判定结果：阳性血清可以用肉眼辨认，为清亮的黄色，用ELISA检测仪检测每一孔的光吸收值，检测波长为492nm。任何一种血清，只要它的吸收值超过同一块板中阴性对照血清平均吸收值的两倍，就可判为阳性。

附录A

（标准的附录）

样品DNA的制备

A.1　将组织放入有灭菌沙子的研钵中研磨成糊状，加5～10ml含1%牛血清0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，对研碎的组织作10倍稀释，制作成组织悬液。

A.2　全血样品可用含1%牛血清0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液作1∶1000倍稀释，制成悬液。

A.3　如为污染物的样品（如粪便等），用含0.1mol/L的磷酸盐缓冲液作10倍稀释，制成悬液。

A.4　500r/min离心5min。

A.5　取500μl加入有螺旋帽的离心管中，煮沸10min。

A.6　用小型高速离心机以13000r/min离心5min。

A.7　取10μl上清液用作PCR试验的样品DNA。

附录B

（标准的附录）

电泳缓冲液的制备

B.1　琼脂糖凝胶的TAE缓冲液（50倍）

三羟甲基氨基甲烷碱　　　　　　　　　               　　 242g

冰乙酸　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　57.1ml

0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）　　　　　100ml

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　700ml

待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000ml，置4℃冰箱备用，如配制2%的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。

B.2　2%琼脂糖凝胶板的制备

取1g琼脂糖加入至50ml TAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加入最终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，用TAE定容至50ml，冷却至60℃后，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足量电泳缓冲液。

附录C

（标准的附录）

酶联免疫吸附试验溶液的配制

C.1　0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配制

将下列试剂按次序加入2000ml体积的容器中。

氯化钠　　　　　　　　　　80.06g

氯化钾　　　　　　　　　　20.02g

磷酸氢二钠　　　　　　　　11.50g

磷酸二氢钾　　　　　　　　2.01g

双蒸馏水　　　　　　　　　800ml

混匀，用pH试纸调pH至7.2，用双蒸水定容至1000ml。

C.2　底物溶液

C.2.1　0.1mol/L pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液

下列试剂按次序加入1000ml体积的容器中，充分溶解即成。

磷酸氢二钠　　　　　　　　　　71.6g

柠檬酸　　　　　　　　　　　　19.2g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　1000ml

C.2.2　底物溶液

0.1mol/L pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液　　　　   　100ml

邻苯二胺　　　　　　　　　　　　　　　　　　　40mg

30%过氧化氢　　　　　　　　　　　　　　　　　0.15ml

此液对光敏感，应避免强光直射。现配现用。