二、光谱技术
（一）紫外和可见光谱法
紫外和可见光谱法是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术，应用十分广泛。其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值，而比色计是一种较简单的测量仪器，其原理是利用滤光片来测量较宽波段（如可见光中的绿光、红光或蓝光范围）的吸收值。
1.紫外光/可见光分光光度计
分光光度计是一种靠光栅或棱镜提供单色光的比色计。不论型式如何，各种型号的分光光度计基本上都由五部分组成（图2-5）：①光源；②单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；③吸收池；④接收检测放大系统；⑤显示或记录器。
图2-5 分光光度计基本结构
分光光度计的工作原理与光电比色计相似，但它的单色器比滤光片所选择的波长范围要小得多，为3～5nm，因此是较单纯的单色光。其次，它不仅能在可见光区域内测定有色物质的吸收光谱，而且也能在紫外区及红外区域测定无色物质的吸收光谱。
分光光度计常用的光源有两种，即钨灯和氘灯。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨灯。在紫外光区，多使用氘灯。通常，用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
分光光度法（spectrophotography）是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度A或光密度OD）或透射程度（透光度T），以波长λ作横坐标，A或T为纵坐标，画出连续的“A-λ”或“T-λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线（图2-6）。
图2-6 吸收光谱曲线示意图
由图2-6中可以看出吸收光谱的特征：
（1）曲线上A处称为最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。
（2）曲线上B处称为最小吸收，它所对应的波长称为最小吸收波长，以λmin表示。
（3）曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰C，称为肩峰。
（4）在吸收曲线波长最短的一端，即曲线上D处，吸收相当强，但不成峰，此处称为末端吸收。
λ max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。
在分光比色分析中，有色物质溶液颜色的深度决定于入射光的强度、有色物质溶液的浓度和液层的厚度。当一束单色光透过有色物质溶液时，溶液的浓度越大，透过液层的厚度越大，则光线的吸收越多。朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律是利用分光光度计进行比色分析的基本原理。
朗伯（Lambert）定律，当单色光通过一吸收光的物质时其光强度随吸光介质的厚度L（cm）增长而呈指数减少：
比尔（Beer）定律，单色光通过一光吸收介质时，光强度随物质浓度［c（mol/L），若不知相对分子质量，则为g/L或%浓度］增长呈指数减少：
两者结合在一起即为朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。
式中 ε——常数，也称摩尔吸光度，L/（mol·cm）；
T——透光度，等于
，通常以百分率表示；
k1、k2——常数。
取对数
式中 lgT——光吸收度A。
若遵循朗伯-比尔定律，且L为一常数，用光吸收度对浓度绘图可得一通过原点的直线。
根据朗伯-比尔定律，作出标准物质吸收对浓度的标准曲线，借助于这样的标准曲线，很容易通过测定其光吸收得知一未知溶液的浓度。
分光光谱技术可用于如下几个方面：
（1）通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。
（2）通过测定不同波长下的吸收来测定物质的相对纯度。在DNA的浓度测定中最为常用，测定
值，纯净的DNA样品的比值为1.8。样品中若混有蛋白，
值将变小。
（3）通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量。
（4）通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，追踪反应过程。
（5）通过测定微生物培养体系中的OD值，可以得到体系中微生物的密度，从而可以对培养体系中微生物的数量进行动态的监测。
2.分光光度计的定量分析
假如已知一种物质在某一波长下的吸光率（通常是该物质的最大吸收值，这时灵敏度最高），这种物质纯溶液的浓度可用朗伯-比尔关系式算出。摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下，比色杯厚度为1cm时的吸收值。该值可以从光谱数据表中查到，也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即为摩尔吸光系数。
比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时，比色杯厚度为1cm时测定的吸光值。该值对于未知分子质量的物质如蛋白质、核酸的测定很有用，这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示。使用公式
=εcL时，比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。
这种简单的方法不能用于测定混合样品。在这种情况下，也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量，如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算。
3.分光光度计使用过程中的几个问题
（1）比色杯的使用和清洗 大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10mm。由于300nm以下的光不能透过玻璃，UV区测量要用石英比色杯。比色杯必须配套，以装有纯溶剂的两个比色杯在相同波长下测定光吸收是否一致来进行配对。
进行测量之前，比色杯要干净，无划痕，外表面干燥，盛装液体到适当高度，并放在比色槽中的正确位置。每次使用后，应立即倒空。然后用蒸馏水冲洗比色杯3～4次，最后用甲醇冲洗，在倒去甲醇后，以洁净空气吹干。生物样品中蛋白质和核酸可能会在玻璃/石英杯的内表面沉积，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡过夜。
（2）狭缝宽度 分光光度计使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色仪器中产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性。要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减少了缝宽也会减少到达监测器的光度，降低了信噪比。缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性和离散光的存在。
（3）测量波长 正确选择波长是测定的关键，一般选择最强吸收带的最大吸收波长（λmax）为测量波长。
（4）吸光度范围 吸光度在0.2～0.7之间时，测量精确度最好。被测样品溶液浓度过大时，应适当稀释，再进行吸光度测定。
（5）选取溶剂要注意以下几点：
①当光的波长减少到一定数值时，溶剂会对其产生强烈的吸收，即所谓“端吸收”，样品的吸收带应处于溶剂的透明范围；
②要注意溶剂的挥发性、稳定性等；
③充分考虑溶质和溶剂分子之间的作用力，尽量采用低极性溶剂。
（二）荧光分光光度法
当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出比照射波长长的光，而当紫外光停止照射时，这种光也随之很快消失，这种光称为荧光。荧光是一种光致发光现象。物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光，但其所发射的荧光强度随着该物质浓度的增大而增大。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称荧光分光光度法。与分光光度法相比较，这种方法具有较高的选择性及灵敏度，试样量少，操作简单，且能提供比较多的物理参数，现已成为生化分析和研究的常用手段。
1.荧光分光光度计
用于测量荧光的仪器种类很多，如荧光分析灯、荧光光度计、荧光分光光度计及测量荧光偏振的装置等。其中实验室里常用的是荧光分光光度计。
荧光分光光度计的结构包括五个基本部分：
（1）激光光源 用来激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等，目前荧光分光光度计以用氘灯为多。
（2）单色器 用来分离出所需要的单色光。仪器中具有两个单色器：一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。
（3）样品池 放置测试样品，都用石英做成。
（4）检测器 作用是接受光信号，并将其转变为电信号。
（5）记录显示系统 检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。
2.荧光分析法
荧光分析有定性和定量两种，一般定性分析采用直接比较法，即将被测样品和已知标准样品在同样条件下，根据它们所发出荧光的性质、颜色、强度等来鉴定它们是否属于同一种荧光物质。荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。
荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。
（1）直接测定法 利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的是直接测定法。某些物质本身能发荧光，只需将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。具体方法有以下两种：
①直接比较法。通过标准溶液的荧光强度F1，已知标准溶液的浓度c1，便可求得样品中待测荧光物质的含量。
②标准曲线法。将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。
为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如，测定维生素B1时，可用硫酸奎宁溶液作为基准；测定维生素B2时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器。
（2）间接测定法 许多物质本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。
间接测定方法有以下几种：
①化学转化法。通过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质。例如，金属离子与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。
②荧光淬灭（quenching）法。这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质所具有使某种荧光化合物的荧光淬灭的能力，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。
③敏化发光法。对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太微弱而无法检测。在此种情况下，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。
以上三种方法均为相对测定方法，实验时须采用某种标准进行比较。
3.影响荧光强度的因素
（1）溶剂 溶剂能影响荧光效率，改变荧光强度，因此，在测定时必须用同一溶剂。
（2）浓度 在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。
（3）pH荧光物质在溶液中绝大多数以离子状态存在，而发射荧光最有利的条件就是它们的离子状态。因为在这种情况下，由于离子间的斥力，最大限度地避免了分子之间的相互作用。每一种荧光物质都有它的最适发射荧光的离子状态，也就是最适pH。因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH范围。
（4）温度 荧光强度一般随温度降低而提高，这主要是由于分子内部能量转化的缘故。因为温度升高，分子的振动加强，通过分子间的碰撞将吸收的能量转移给了其他分子，干扰了激发态的维持，从而使荧光强度下降，甚至熄灭。因此，有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。
（5）时间 有些荧光化合物需要一定时间才能形成，有些荧光物质在激发光较长时间照射下会发生光分解。因此，过早或过晚测定荧光强度均会带来误差。必须通过条件试验确定最适宜的测定时间，使荧光强度达到最大且稳定。为了避免光分解所引起的误差，应在荧光测定的短时间内才打开光闸，其余时间均应关闭。
（6）共存干扰物质 有些干扰物质能与荧光分子作用使荧光强度显著下降，这种现象称为荧光的淬灭；有些共存物质能产生荧光或产生散射光，也会影响荧光的正确测量。故应设法除去干扰物，并使用纯度较高的溶剂和试剂。