三、色谱仪类设备

色谱仪的名称来源于色谱法。色谱法又叫层析法，它是一种物理分离技术。它的分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，叫作固定相；另一相则是推动混合物流过此固定相的流体，叫作流动相。当流动相中所含的混合物经过固定相时，就会与固定相发生相互作用。由于各组分在性质与结构上的不同，相互作用的大小强弱也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后次序从固定相中流出。这种基于两相分配原理而使混合物中各组分获得分离的技术，称为色谱分离技术或色谱分析法。当用液体作为流动相时，称为液相色谱，当用气体作为流动相时，称为气相色谱。该分离过程的原理图如图2－7所示。

用于色谱分析的装置被称为色谱仪，包括检测装置、记录和数据处理分析，最终得到目标物的色谱峰信息（保留时间、峰面积）、光谱或质谱信息。定量计算时，通常基于目标物的色谱峰面积进行。对于形貌规则的色谱峰，色谱峰面积通常是由工作站软件自动积分统计出。

色谱仪在各类产品的分析中得到了广泛应用。现代的色谱仪具有稳定性、灵敏性、多用性和自动化程度高等特点，常见的色谱仪有气相色谱仪（GC）、液相色谱仪（HPLC）、离子色谱仪和凝胶色谱仪等。下面主要对分析测试中使用的气相色谱仪和液相色谱仪进行介绍。

（一）气相色谱仪

1. GC的工作原理

GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离，其流动相为载气。被分析样品在GC的汽化室汽化后，被载气（一般是N₂、He等惰性气体）带入色谱柱，柱内含有固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在载气和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器，并被转变为电信号。电信号的强弱与被测组分的量或浓度成比例，当将这些信号放大并记录下来后，就得到如图2－8所示的色谱图（假设样品分离出两个组分A和B），目标物以峰的形式体现出（即色谱峰），它包含了色谱的全部原始信息。在没有组分流出时，色谱图的记录是检测器的本底信号，即色谱图的 “基线”。

2. GC的结构

市售的气相色谱仪型号繁多，但总的说来，其基本结构是相似的，主要由载气系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统以及数据处理系统构成。图2－9中给出了GC的基本结构图例，图2－10是一款常见的气相色谱仪。

（1）载气系统

载气系统包括气源、气路控制系统、气体净化器。载气是气相色谱工作过程的流动相，原则上说只要没有腐蚀性，且不干扰样品分析的气体都可以作载气，常用的有He、N₂、H₂、Ar等。在实际应用中载气的选择主要是根据检测器的特性来决定，同时考虑色谱柱的分离效能和分析时间。载气的纯度、流速对色谱柱的分离效能、检测器的灵敏度均有很大影响。气路控制系统的作用就是将载气及辅助气进行稳压、稳流及净化，以满足气相色谱分析的要求。

原则上讲，选择气体纯度时，主要取决于分析对象、色谱柱中的填充物以及检测器。建议在满足分析要求的前提下，尽可能选用纯度较高的气体。这样不但提高仪器的灵敏度，而且能够延长色谱柱和整台仪器（气路控制部件、气体过滤器）的寿命。实践证明，作为中高档仪器，长期使用纯度较低的气体气源，一旦要求分析低浓度的样品时，要想恢复仪器的高灵敏度性会十分困难。

（2）进样系统

进样系统包括进样器和汽化室。它的功能是引入试样，把液体样品瞬间加热变成蒸气，然后由载气带入色谱柱。气体样品可以用六通阀进样，进样量由定量管控制，可以按需要更换，进样量的重复率可达0.5%。液体样品可用微量注射器进样，重复性比较差。在使用时，注意进样量应与所选用的注射器相匹配，最好是在注射器最大容量下使用。工业流程中色谱分析和大批量样品的常规分析常用自动进样器，结果的重复性很好。进样时，由于毛细管柱样品的容量很小，一般采用分流进样器，这样汽化后的样品只有一小部分被载气带入色谱柱，大部分被放空。

（3）分离系统

分离系统主要由色谱柱组成，是气相色谱仪的心脏，它的功能是使试样在柱内运行的同时得到分离。色谱柱基本有两类：填充柱和毛细管柱。填充柱是将固定相填充在金属或玻璃管中（内径通常为4mm）。毛细管柱是用熔融二氧化硅拉制的空心管，也叫弹性石英毛细管。柱内径通常为0.1~0.5mm，柱长30~50m，绕成直径20cm左右的环状。用这样的毛细管作分离柱的气相色谱称为毛细管气相色谱或开管柱气相色谱，其分离效率比填充柱要高得多，可分为开管毛细管柱、填充毛细管柱等。填充毛细管柱是在毛细管中填充固定相而成，也可先在较粗的厚壁玻璃管中装入松散的载体或吸附剂，然后拉制成毛细管。如果装入的是载体，使用前在载体上涂渍固定液成为填充毛细管柱气－液色谱。如果装入的是吸附剂，就是填充毛细管柱气－固色谱，但这种毛细管柱近年来已不多用。

毛细管柱分以下4种：

①壁涂毛细管柱：在内径为0.1~0.3 mm的中空石英毛细管的内壁涂渍固定液，这是目前使用最多的毛细管柱。

按照固定液的极性强弱，通常又被分为如下4种类型：

a. 非极性和弱极性：其与目标物分子之间的作用力以色散力为主，组分在此类固定相上按照沸点由高到低顺序出峰，适用于非极性和弱极性化合物的分析，例如非极性HP－1、DB－1、Ultra－1及弱极性HP－5、DB－5、Ultra－2色谱柱。

b. 中等极性：它们与待测物质分子之间的作用力以色散力和诱导力为主，组分基本上按沸点顺序出峰，适用于弱极性和中等极性化合物的分析，例如HP－1701、HP－35、HP－624、DB－1701、DB－35等色谱柱。

c. 极性：含有较强的极性基团，它们与待测物分子间的作用力以静电力和诱导力为主，组分按照极性由小到大顺序出峰，适用于极性化合物的分析，例如HP －608、OV－275等。

d. 氢键型：是强极性固定液中的特殊的一类，其与待测物分子间的作用力以氢键为主，组分按照形成氢键的难易程度出峰，不易形成氢键的组分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，适用于分析含有F、N、O的化合物，如HP－FFAP、HP－Innowax、HP－WAX等。

② 载体涂层毛细管柱：先在毛细管内壁附着一层硅藻土载体，然后在载体上涂渍固定液。

③ 小内径毛细管柱：内径小于0.1 mm的毛细管柱，主要用于快速分析。

④大内径毛细管柱：内径0.3~0.5 mm的毛细管，往往在其内壁涂渍5~8μm的厚液膜。

因此，在实际检测过程中，可根据如下原则，选择含有合适固定液的毛细管色谱柱，以达到良好的分离效果：

① 极性相似：待测物组分分子与固定液分子极性相似。

② 官能团相似：若待测物为酯类，宜选用酯或聚酯类固定液；若待测物为醇类，可选用聚乙二醇固定液。

③ 按性质差别选择：若待测各组分之间沸点差异明显，可选用非极性固定液；若极性是主要矛盾，则选用极性固定液。

（4）检测系统

检测系统的核心是检测器。检测器的功能是把柱后已被分离的组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对各组分的组成和含量进行鉴定和测量，故此被比喻为色谱仪的眼睛。原则上，被测组分和载气在性质上的任何差异都可以作为设计检测器的依据，但基于实际使用中的方便性、通用性、选择性及价格来考虑，GC常用的检测器通常只有以下几种：

① 热导检测器（TCD）：TCD主要用于气体检测，价格低，但灵敏度不高。

②火焰离子化检测器（FID）：FID属于选择性检测器，只对碳氢化合物产生信号，其特点是体积小、灵敏度高（灵敏度比TCD高100倍以上），稳定性好，线性范围宽，是最常用的检测器。

③电子捕获检测器（ECD）：该检测器的检测池含有放射性同位素，通常是63 Ni发射出射线，射线和载气分子碰撞而产生低能量的自由电子，在两电极间施加极化电压以捕集电子流，某些分子能够捕获低能量的自由电子而形成负离子。当此类化合物分子进入检测池时，部分电子被捕获从而使得收集电流下降，信号经过处理后形成色谱图。因此ECD是一种高选择性、高灵敏度的检测器。其只对具有电负性的物质如卤素、S、P、N有响应，而且电负性越强，灵敏度越高，适用于痕量电负性物质的检测，如多卤、多硫化合物。

ECD对含卤素化合物有很高的灵敏度，是卤素类有机物的专用检测器。

④质谱检测器（MS）：利用质谱图进行鉴定，是最强力的一种手段。MS已经成为目前实验室中GC的标准配置。

在进行MS分析时，首先要把样品分子或原子电离成离子，产生离子的装置叫离子源。目前比较普遍使用的是电子轰击源（EI）和化学离子源（CI）。EI是在高真空下，用强电子流直接轰击气态样品，使之发生电离，国际上普遍采用的电子流强度为70 eV。EI源重现性好，所得信息量多，而且配有标准质谱图库（NIST）作为定性参考依据。其缺点在于分子离子峰丰度小。CI是利用电子流轰击低压的样品气和高压的反应气，反应气首先被打掉电子形成离子，这些离子再接受样品分子的电子，发生离子分子反应来完成样品的离子化。CI属于软电离方式，分子离子峰强度最大，因此图谱解析较容易，缺点是重现性差。其它电离方式还有场电离、场解吸电离、快速原子轰击电离等，但使用较少。

另外，为提高定性鉴别的准确性，可进一步采用串联质谱仪（MS/MS）进行二次电离，但MS/MS价格通常较高，应用普及率很低。

以上4种检测器基本能够完成GC的大部分工作，还有其它一些检测器起互补作用，一般是元素专属性检测器或质量选择性检测器，如氮磷检测器（NPD），用于检测含磷含氮化合物；火焰光度检测器（FPD），用于检测含磷含硫化合物；原子发射检测器（AED），可用于多种元素检测。这些检测器多用于特殊的化合物分析。

（5）数据处理系统

数据处理系统目前多采用配备操作软件包的工作站，用计算机控制，既可以对色谱数据进行自动处理，又可对色谱系统的参数进行自动控制。

（二）液相色谱仪

液相色谱仪是以液体作为流动相的色谱仪。由于所用的流动相通常是在高压条件下输送的，所以又称为高压液相色谱仪或高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography），简称HPLC。HPLC引用了气相色谱的理论，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，使柱效可达几万至几十万（每米塔板数）；同时色谱柱后连有高灵敏度的检测器，可对分离出的目标物进行连续检测。图2－11是一款常见的液相色谱仪。

与GC相比，HPLC在分离性能、灵敏度、分析速度等方面稍弱，但GC不能用于沸点太高或热稳定性差的物质。对于HPLC，只要试样能制成溶液即可，而不需要加热汽化，因此不受试样沸点和热稳定性的限制。原则上，对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%~80%）都可应用HPLC来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用GC分析的约占20%，而能用HPLC分析的占70%~80%。

1. HPLC工作原理

使用HPLC时，含有目标物的样液被注入色谱柱，通过液体压力在固定相中移动，由于样液中不同物质与固定相的相互作用不同，导致不同的物质逐次离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号，判断待测物所含有的物质（图2－7）。

2. HPLC的类型及其分离机制

色谱柱是色谱分离的心脏。根据色谱分离机制的不同，HPLC可分为液－液分配色谱法、液－固分配色谱法、离子交换色谱法（离子色谱法）、离子对色谱法和凝胶色谱法。由于本书中所涉及的目标物的检测主要采用液－液分配色谱法，因此本节中只对该色谱法进行叙述。

（1）固定相

液－液分配色谱法的固定相为液体，涂渍在担体（载体）上，目前多通过化学键合固定于担体上，以减少固定相流失。常用的固定相如极性的 β，β′ －氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

（2）分离作用机制

溶质在液－液两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分由于较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液－液色谱法与液－液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：

K ＝ C _固 /C _液

式中 C_固——组分在固定液中的浓度；

C_液——组分在流动相中的浓度。

K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

（3）正相色谱和反相色谱

正相色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷、异丙醇等）作流动相。反相色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、乙腈等）作流动相。

一般而言，正相色谱的固定液极性大于流动相，而反相色谱的固定相极性小于流动相。因此，正相色谱适宜分离极性化合物，反相色谱则适宜分离非极性或弱极性化合物。

（4）应用

液－液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、甾族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以采用液－液色谱进行分离。

3. HPLC的结构

HPLC主要由进样系统、液体输送系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成，其结构示意图如图2－12所示，最终所得到的色谱图与图2－8相似。

（1）进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，进样量通常是恒定的，一般进样量为10μL，超高压液相色谱进样量一般为2μL。进样系统通常还包含真空脱气机，以消除流动相中的微量气泡对色谱柱分离效果的影响。

（2）液体输送系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。通常高压泵流速可调且稳定，以降低样品在柱中的扩散效应，加快其在柱中的移动速度。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH，或改用竞争性抑制剂或变性剂等，以使目标物获得有效分离。

（3）分离系统

该系统包括色谱柱和恒温器/柱温箱等。色谱柱一般由不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，内装有粒度直径为5~10μm的固定相（由基质和固定液构成），固定相中的基质是由机械强度高、惰性、多孔、比表面积大的树脂或硅胶构成，其结构对不同的目标物有良好的选择性。

色谱柱通常安装在恒温器中，以消除温度波动对分离效果的影响。恒温器可使分离时的温度从室温调节至约60℃，从而改善传质速度，缩短分析时间，提高色谱柱的分离效率。

（4）检测系统

HPLC常用的检测器有紫外吸收检测器（UV）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）、示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）、质谱检测器（MS）等。其中UV、DAD、FLD和MS使用最多。

①紫外吸收检测器（UV）：UV是目前HPLC中应用最广泛的检测器，其适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。特点是灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，属于选择性检测器。

② 荧光检测器（FLD）：FLD适用于能激发荧光的化合物的测试，例如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等，其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中是最高的，应用也较广，仅次于UV。FLD在生物样品痕量分析中很常用，尤其在用荧光衍生后，可以检测微量的氨基酸和肽。

③ 二极管阵列检测器（DAD）：DAD是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器，可以看作是UV的一个分支。DAD可对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱，所得到的光谱用于定性、色谱峰用于定量。因此DAD比UV和FLD更适合于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。

④质谱检测器（MS）：MS一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子质量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。从HPLC出来的被分离组分依次通过接口进入质谱仪，在质谱仪中首先于离子源处被离子化，然后离子在加速电压作用下进入质量分析器进行质量分离。分离后的离子按质量的大小先后被收集器收集，并记录质谱图，根据质谱峰的位置和强度可对样品的成分和其结构进行分析，并通过色谱图中的色谱峰进行定量计算。

由于流动相的差异，LC－MS的电离方式与前面叙述的GC－MS的电离方式（EI和CI）有所不同。常见的离子源为电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。采用ESI时，样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，适合于极性大的样品。ESI有正离子（ESI+）和负离子（ESI－）两种模式，其中ESI+应用于电离后带正电荷的物质（如季铵盐），ESI－应用于电离后带负电荷的物质（如羧酸、酚类）。

ESI是一种软电离方式，即便是分子质量大、稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，因此它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子质量为10000 u的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000，进入了质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子质量在300000 u以上的蛋白质。

采用APCI时，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，其适合于极性小的样品（如多环芳烃）。由于在被检测的目标物中，极性样品占主体，所以ESI比APCI用途广泛，通常以APCI作为ESI的补充。

（5）数据处理系统

通常指安装在电脑中的工作站软件。该软件可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作顺利地快速开展。