第二节 微生物学研究技术
一、显微技术
微生物形体微小，对微生物个体和细胞的研究，离不开显微技术。显微技术包括精确使用显微镜、精心制作标本片和科学采集与处理图像技术。
1.光学显微术
光学显微镜以可见光为成像介质，有效放大倍数为1000～1500倍，能分辨的两点之间最小距离为0.2μm左右。此外，相差显微镜可以观察活细胞或未染色标本，能更清晰地观察到活细胞的细微结构；暗视野显微镜可用来鉴别各种死活酵母细胞，对于梅毒螺旋体等娇弱微生物的观察也特别有用；多种荧光显微镜，如发光二极管荧光显微镜、结构光照明荧光显微镜、全内反射荧光显微镜等，在特异性荧光染色后，可用于观察细菌拟核、真核生物细胞核等细胞器，区分原生质体，还可普遍应用于免疫学、环境微生物学和分子生物学的相关研究。
2.电子显微术
扫描电子显微镜以聚焦电子束在试样表面逐点扫描成像。试样为块状或粉末颗粒，成像信号可以是二次电子、散射电子或吸收电子。扫描电镜制样方法简单，可以观察直径大到30mm的大块试样；场深大，适用于粗糙表面和断口的分析观察；图像富有立体感、真实感，易于识别和解析；放大倍数一般为15万～20万倍，最大可达10万～100万倍；分辨率一般为2～6nm，最高可达0.5nm；可以通过电子学方法有效地控制和改善图像的质量，可在荧光屏上同时观察不同放大倍数的图像或不同形式的图像；可进行多种功能的分析，如与X射线谱仪配接可进行微区成分分析，配有光学显微镜和单色仪等附件时可观察阴极荧光图像和进行阴极荧光光谱分析等；结合冰冻蚀刻技术，可观察亚细胞结构。
透射电子显微镜利用透过样品的电子束成像，分辨率可达0.1nm。透射电镜镜筒中要求高真空，用电磁圈使电子束汇聚、聚焦，用显示屏来显示或用感光胶片做记录，样品需要超薄切片。电子显微镜的发明，有力地促进了微生物个体、细胞、亚细胞等水平的研究。
冷冻电子显微术是结构生物学研究的重要技术手段，其解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤。可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前使用的主要几种冷冻电子显微学结构解析方法包括电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。
3.扫描隧道显微术
扫描隧道显微镜利用量子力学的隧道效应和三维扫描，用一个极细的尖针（针尖头部为单个原子）去接近样品表面，当针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV～2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离呈函数关系。当探针沿物体表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。原子力显微镜、激光力显微镜、弹道电子发射显微镜、光子扫描隧道显微镜以及扫描近场光学显微镜等都属于扫描隧道显微镜。原子力显微镜利用原子之间的范德华力作用来呈现样品的表面特性。利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构如生物膜、细胞壁等的原子排列。
4.扫描电化学显微术
扫描电化学显微术是一种分辨率介于普通光学显微镜与扫描隧道显微镜之间的电化学现场检测新技术。它通过超微电极（探针）靠近基底或在靠近基底的区域内移动时产生的电流信号来研究体系电化学性质及基底形貌。用电流法和电位法（离子选择电极）可观察人工或天然的生物体系，如DNA与小分子相互作用、生物酶活力的分布、原生质光合作用、抗原抗体作用、活细胞研究及媒介反应动力学等。
5.激光共聚焦显微术
激光共聚焦显微镜由荧光显微镜、扫描、计算机控制3部分组成。利用激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦平面的每一点进行扫描，标本上的被照射点在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管或冷电耦器件逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。激光共聚焦显微镜以极高的分辨率对较厚标本的细节进行观察，可对溶酶体、线粒体等亚细胞以及细胞骨架、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异结构的含量、组分及分布进行定性、定量、定时及定位测定，并能重建三维图像，在医学、动物学、生物化学、微生物学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学和海洋生物学等学科领域具有广泛的应用。
二、高级质谱技术和代谢组学技术
在诊断微生物学中，采用基质辅助激光解吸/离子化质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS）可从血清和组织样品直接测定分子谱，用于病原菌-宿主互作研究和发现潜在的感染标记。它能原位测定组织切片的特异性分子，并进行二维和三维立体分析，达到快速鉴定病原细菌的目的。利用质谱成像（imaging mass spectrometry）技术和实时质谱技术（real-time mass spectrometry），不需繁杂的样品预处理，即可二维和三维分析微生物菌落和群落产生的特异性代谢产物的分布。采用这些方法捕获分子的速度依赖于新的分子可视工具如分子网络（molecular networking）的发展与应用。
代谢组（metabolome）是指一个生物或细胞在特定生理时期内所有低分子质量代谢物的集合（包括代谢中间产物、激素、信号分子和次生代谢产物）。它是细胞变化和表型之间相互联系的核心，直接反映了细胞的生理状态。代谢组学（metabolomics）是对某一生物或生物系统内所有代谢物（通常小于1ku）进行定性和定量分析的一门科学，能够为进一步了解相关代谢途径及其变化提供关键的信息。代谢组学的概念普遍认为是英国帝国理工大学的Nicholson教授于1999年提出来的。目前，微生物代谢组学已被广泛应用于不同的研究领域，如生物医药开发、环境污染物降解途径、特定环境中微生物的鉴定、诱变育种、功能基因研究、代谢工程和发酵工程等。代谢组学研究通常包括三个步骤：样品制备（灭活酶，胞外和胞内代谢物分离与提取），联合应用多种分离与鉴定技术如质谱（MS）、核磁共振（NMR）、液质联用（LC-MS）和气质联用（GC-MS）等分离和鉴定代谢物分子，以及数据处理和分析。基于NMR的方法在表征代谢物结构和量化测定方面无与伦比，而且样品预处理少（有时候需要完整细胞/个体）；但是其灵敏度要小，约为质谱方法的1/1000～1/100，而且在解析复杂混合物时有局限。LC-MS在其灵敏度和动态测定方面相对于NMR和其他波谱方法如紫外（UV）和红外（IR）光谱优势明显，能从包含数千分析物的复杂混合物分辨和鉴定代谢物原态，复杂分析物丰度变化可达10000倍；但其缺陷是难以有效地测定挥发性代谢物，而且在代谢物的结构鉴定和绝对量化能力方面有局限。GC-MS可以量化测定挥发性和不带电荷的代谢物、同质异构化合物（如糖和脂）；但GC-MS需要多种化学衍生化，因此需要预知目的分子的化学性质。多种高级质谱设备，如三级四极质谱仪在测定预先指定的分析物中灵敏度较高，配备高分辨全扫描检测器（如飞行时间或Orbitrap质谱仪）能无偏差量化已知和未预期代谢物，通常用于测定其原子组成和经验分子式。
三、高通量测序技术
高通量测序（high throughput sequencing）技术区别于传统的桑格（Sanger）链末端测序技术，不需要将模板DNA克隆到载体上，而是首先将DNA片段化，PCR扩增后测序，因而又称二代测序（next generation sequencing）技术。高通量测序采用相对简单的台式技术和有效的文库制备方法，显著降低了成本、提高了速度、增加了读长。目前，二代测序主要有如下几种技术。①焦磷酸测序（Roche 454）：为较早的二代测序技术，主要原理是往测定体系内加入互补核苷酸，检测模板序列释放的焦磷酸。该技术的缺点是手工操作时间长，需要微乳滴PCR（emPCR）人工扩增测序文库；每个碱基的成本较高。罗氏454测序系统经过多次升级，最新一代454 GS FLX基因组测序仪将焦磷酸测序原理与微流体技术整合，配合Titanium系列测序试剂，具有更高的测序通量和更加广泛的灵活性和准确性，并且保持了新一代测序技术中运行速度快和单序列读长高的优势，且单一读长的准确性和完整测序结果一致的准确性均有提高。②离子半导体测序（life technologies ion torrent）：有搭载半导体芯片的Ion TorrentTM个人化操作基因组测序仪（Personal Genome Machine，PGM）和搭载更先进芯片的高通量Ion ProtonTM系统平台，采用边合成边测序技术，检测随着互补DNA的合成而释放氢离子而引起的pH的改变。该测序技术成本较低，但测序特别是同源多聚体错误率较高，对极端AT丰富或GC丰富区域的覆盖率较差。③Illumina测序：采用边合成边测序的方法，检测掺入测序序列的核苷酸释放的荧光标记。目前该技术是高通量测序的市场领导者，错误率和成本均较低；其缺陷是读本序列稍短，因而对长测序需要更长时间。最近引入TruSeq长读本技术，可产生长达10kb的合成读本（目前仅有HiSeq2000/2500平台）。单分子实时测序（pacific biosciences）和纳米孔测序（oxford nanopore）等新开发的测序技术也称为三代测序技术，技术成熟以后将更大地促进生物组学研究。
高通量测序技术的推广应用，极大地降低了基因组测序的成本。例如，采用鸟枪法，基于桑格测序技术，人类基因组测序耗时20年，花费30亿美元才得以完成；而采用高通量技术进行人类基因组测序，成本将从2001年的9500万美元降低到2013年的不到6000美元。采用高通量测序技术，已经完成了上千种各种生物包括微生物的基因组测序。测序技术和生物信息学、计算工具、设备和数据的分析与注释技术的发展与进步，为微生物学研究带来了革命性的变化。微生物学研究进入“组学”时代。
四、基因组编辑技术
基因组编辑（genome editing）是在基因组尺度对细胞进行有效设计与高效改造，如基因组上多个位点同步插入或删除，通过多个代谢分支途径的组合优化和外源代谢路径的大片段基因组整合等，实现全新代谢能力的改造。这种基因组尺度的高效编辑技术主要包括对基因组上多重位点进行同步改写、高效插入、替换或删除、大片段的剪切-粘贴以及自主编辑（即基因组程序性进化）等。
1.基因组多重位点的同步编辑技术
基因组上多重位点的同步编辑可用于工业微生物组合调控多个酶的表达水平，实现分支路径弱化与主代谢路径强化的同步等，克服多重代谢通量的细胞代谢网络改造的困难。该类编辑技术主要有寡核苷酸介导的基因组多重位点编辑技术，如基于λ噬菌体基因Red区段的β-重组蛋白的基因组多重位点自动改造技术（multiplex automated genome engineering，MAGE）及在此基础上改进的单链DNA（ssDNA）介导的基因组编辑技术，以及选择标记辅助的多重位点编辑技术如CoS-MAGE技术等。
2.双链断裂介导的高效插入、替换和删除
通过自定义人工核酸酶，精确识别并切割基因组特定位点，形成双链断裂，进而通过胞内的DNA修复系统实现基因组的编辑，包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）介导的基因组编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）介导的基因组编辑技术、CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein 9）介导的基因组编辑技术等。
3.基因组大片段的插入、删除和剪切-粘贴
大片段DNA插入或删除技术主要是由位点专一性重组酶和它的特异性识别位点组成，包括最早被识别的λ噬菌体溶源性基因组整合系统（整合酶和专一性位点——自身基因组上的attP位点和宿主基因组上的attB位点）、P1噬菌体的Cre/lox重组系统、酵母的Flp/FRT重组系统等。该类技术包括位点专一性重组酶的基因组编辑技术、二型内含子归巢介导的基因组编辑技术和基因组大片段DNA高效编辑技术。
4.基因组自主编辑
应用基因组进化，近几年开发了一些新的基因组进化技术，以实现基因组自主编辑，如结合原生质体融合的基因组重排技术、改造基因组范围转录调控程序的全局转录因子工程、基因组复制机器工程辅助的连续进化以及环境条件诱导的适应性进化策略等。