第一节 原核生物的分类与系统学

原核生物分类学（prokaryotic taxonomy）是研究原核生物分类理论和技术方法的学科，其具体研究内容包括原核生物的分类（classification）、鉴定（identification或determination）和命名（nomenclature）。分类是根据一定的原则（表型特征相似性或系统发育相关性）对原核生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的原核生物进行鉴定，即根据现有数据建立系统的过程；鉴定是借助于现有的原核生物分类系统，通过特征测定，确定未知的或新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程，即根据现有系统确定未知原核生物分类归属的过程；命名是根据命名法规，给每一个分类群一个专有名称。原核生物系统学（prokaryotic systematics）是研究原核生物类群间的异同以及异同程度，阐明原核生物间的亲缘关系、进化过程和发展规律的科学。系统学不是根据表型，而是在16S rDNA序列比对分析的基础上，以系统发生（进化）的框架为基础。原核生物系统学涉及对原核生物的分离、描述、鉴定、分类、命名和菌种的保藏等内容，可以看作现代原核生物分类学，是原核生物学的重要基础学科。

一、伯杰氏原核生物分类系统

伯杰氏分类系统是当前国际普遍采用的最权威分类系统。《伯杰氏细菌鉴定手册》（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）是本分类系统的标准指南，由美国细菌学家协会（现在的美国微生物学会）发起编写，最初指定伯杰作为编委会主席，在1923年出版了手册的第1版，并分别于1974和1994年出版第8版和第9版。1984—1989年改名为《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology），出版第1版。《伯杰氏系统细菌学手册》第1版是在《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版的基础上修订的，在一些类群增加了不少有关核酸杂交、16S rRNA基因序列分析等系统发育方面的资料，提出了许多新的分类单元。该版未能全面按照界、门、纲、目、科、属、种系统分类体系进行安排，而是从实用出发，主要根据表型特征将整个原核生物分为33组，然后进一步分类描述各组原核生物。该版本共4卷，其中第1卷描述第1～11组，包括一般的、医学或工业上重要的革兰阴性细菌；第2卷描述第12～17组，包括放线菌以外的革兰阳性菌；第3卷描述第18～25组，包括光合细菌、蓝细菌、古生菌和其他革兰阴性菌；第4卷描述第26～33组，包括能形成菌丝体的放线菌。虽然《伯杰氏系统细菌学手册》第1卷未能进行真正的系统分类，但它的许多细菌系统发育资料可供参考。

1994年出版的《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版几乎是《伯杰氏系统细菌学手册》第1版的缩写版，除了对细菌各属关键表观特征的描述外，属内各种的鉴定特征以表格的形式出现。这对于鉴定工作十分方便。鉴定手册共包括4个类别，35群细菌。群的划分依据为表型特征如形态、生理和营养类型。

《伯杰氏系统细菌学手册》第2版共分5卷，根据16S rRNA基因的系统发育资料对分类群进行了相当大的调整（革兰阴性细菌分类调整的幅度很大），将原核生物分成古生菌域和细菌域。古生菌域分为2门，细菌域分为26门。

《伯杰氏系统细菌学手册》第2版第1卷于2001年出版，主要包括古生菌、最早分枝的细菌及光能营养细菌，具体包括古生菌域的泉古生菌门（Crenarchaeota）和广古生菌门（Euryarchaeota），细菌域的产液菌门（Aquificae）、栖热袍菌门（Thermotogae）、热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteria）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、金矿菌门（Chrysiogenetes）、绿屈挠菌门（Chloroflexi）、热微菌门（Thermomicrobia）、硝化螺菌门（Nitrospira）、铁还原杆菌门（Deferribacteres）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和绿菌门（Chlorobi）。

第2卷于2004年出版，主要描述了变形菌门（Proteobacteria）内538属的2000多种细菌。变形菌门是最大的原核生物门，主要包括形态及生理学特征多样的革氏阴性菌，已经记录约6250种。该卷又分为3亚卷，亚卷A是简介，亚卷B描述了伽玛变形菌纲（Gammaproteobacteria），亚卷C描述了阿尔法变形菌纲（Alphaproteobacteria）、贝塔变形菌纲（Betaproteobacteria）、德尔塔变形菌纲（Deltaproteobacteria）和艾普西隆变形菌纲（Epsilonproteobacteria）。

第3卷于2009年出版，为厚壁菌门（Firmicutes），也称为低G+C含量的革兰阳性原核生物。该卷描述了235属，超过1346种。比较知名的属有：梭菌纲（Clostridia）的梭菌属（Clostridium）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、真杆菌属（Eubacterium）、脱硫肠状菌属（Desulfotomaculum）、韦荣菌属（Veillonella）等；芽孢杆菌纲（Bacilli）的芽孢杆菌属（Bacillus）、显核菌属（Caryophanon）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和利斯特菌属（Listeria）等。

第4卷于2010年出版，主要包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、无壁菌门（Tenericutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、丝状杆菌门（Fibrobacteres）、梭菌门（Fusobacteria）、网团菌门（Dictyoglomi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、衣原体门（Chlamydiae）和浮霉状菌门（Planctomycetes）等12门。

第5卷出版于2012年，为放线菌门（Actinobacteria），也称高G+C含量的革兰阳性菌。该卷描述了49科的200多个属，包括很多医学和工业重要的分类单元。

二、原核生物分类与鉴定的特征与技术

1.原核生物分类与系统学一直处于不断发展变化之中

分子生物学技术和基因组测序技术的发展和应用给原核生物分类与系统学的发展带来了显著的影响。《伯杰氏细菌鉴定手册》第4版（1934年）描述了132个属和2703个种（包括亚种和变种），而2013年8月有名字和占据分类地位的属和种的数量分别为2390和11482，其中包括1934年识别的75个属和250个种。在2006—2012年，每年平均加入524个新种。在过去的80多年里，原核生物分类学领域已经发生了很大变化，种、亚种和更高分类元的数量不断增加，分类学指标和技术、命名原理等也发生了很大改变。现在使用的分类概念（如域、门）源自于广泛采用16S rRNA基因序列分析。族、亚族、亚属等分类学概念没有沿袭下来。1934年识别的种在现在的分类学里只保留不到10%。

2.原核生物分类与鉴定的原则

（1）多相表征（polyphasic characterization）原则 经典和严谨的原核生物分类和系统学研究工作量很大，是件很辛苦、枯燥和耗时的工作。目前的很多研究工作基本上模式化和程序化，包括采样、纯种分离、16S rRNA基因序列测定、从基因比对分析中选择典型相关菌株、测定一系列表型特征、命名、将典型菌株存放于不同国家的2个典型培养物保藏中心、写作论文。通过这样程序化的研究工作发现的新种、新属等分类元，因为没有与最邻近分类元的典型菌株、典型种、典型属等进行遗传学、表型特征、基因组序列特征等方面的充分比较研究，没有确信表明分离物的新颖性，没有充分挖掘描述菌株的更多未被识别的生物学特征、潜在开发利用价值等，难以让人信服。

对新分类元的描述必须整合表型、化学分类和基因型特征，不能基于单一观察如16S rRNA基因序列与其最邻近分类元具有较低的系统发育相似性，或DNA-DNA杂交值低于主观规定的阈值。完整描述新种要测试的特征很多，包括遗传学特征（DNA G+C摩尔百分含量、DNA-DNA杂交、16S rRNA基因分析、基因组序列分析、核酸指纹分析等）和表型鉴定（形态、生理生化、细胞化学组成等）等。

（2）必须设立对照原则 原核生物表型种的概念是与典型培养物（菌株）紧密相关的菌株集合体。为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，原核生物系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”。种和亚种指定模式菌株（type strain），亚属和属指定模式种（type species），“属”以上至“目”分类单元指定模式属（type genus），其中模式菌株应送交至少两家菌种保藏机构保藏，以备查考和索取。因此，在原核生物分类鉴定中，特别是确定新的分类单元，必须与近缘模式菌株（确定新种）、模式种（确定新属）、模式属（确定更高分类单元）进行比较研究。所用的对照要覆盖所有已知的下一级分类单元；而且在测试中不但要设立阳性对照，还要设立阴性对照。这样的研究结果，才更客观、更有说服力。

（3）单独16S rRNA基因序列分析不能准确确立新种关于16S rRNA基因的序列分析有一个广泛的误解：如果新分离物与近缘菌株（特别是可培养的菌株）有小于97%的16S rRNA相似性，可保证描述新种；而该值大于97%，则表明该分离物属于已知的种。实际上，一些原核生物包含多个高度趋异拷贝的16S rRNA基因。单独16S rRNA基因序列相似性本身用于描述种是勉强的，不存在“97%相似性法则”，经常引用的16S rRNA基因序列数据与DNA-DNA复性相关也是误解。最近出现了很多只采用16S rRNA基因序列快速筛选新种系型（phylotypes）的报道。但是，要想确认特定种系型的分类学地位，还是必须将目标菌株进一步多相表征，包括与近缘菌株进行多种表型测试，必要时还要进行DNA-DNA复性研究。

（4）创立新种的“黄金标准” DNA-DNA复性是创立新种的“黄金标准”，阈值为70%左右。目前，在实际分类应用中，一般推荐当两个菌株的16S rRNA基因序列相似性大于97%时，要进行DNA-DNA杂交，最终确定是否设立新种。然而，DNA-DNA复性实验费时、费力、成本高、有偏差和难操作。高通量测序技术大大降低了原核生物基因组测序的成本。一个原核生物基因组测序的成本甚至会低于传统的DNA-DNA杂交。平均核苷酸同源性（Average nucleotide identity，ANI）是指两个基因组之间同源基因的相似性。ANI值和DNA-DNA杂交百分数间存在高度相关性，70%DNA-DNA复性相当于94%～96%ANI。ANI测定具有方便、工作量小、错误率低、分辨率高的优点。ANI值测定可取代DNA-DNA杂交，成为原核生物界定种的新黄金标准。然而，在原核生物分类实践中，良好注释基因组序列也不能取代新个体的完全表型和化学分类特征。

（5）测试的表型特征原核生物分类与鉴定需要测试的表型特征包括菌体生长的温度、pH和盐分、革兰染色、与氧气和其他末端电子受体的关系、吲哚实验等，以及后来建立的极性脂、全细胞脂肪酸成分、呼吸醌和肽聚糖结构测试等，还包括最近发展的全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）和拉曼光谱。MALDI-TOF-MS能测定非片段化的大分子，FT-ICR-MS能检测数千种分子质量范围120～800u的代谢产物的元素组成，拉曼光谱为非扩散性和非破坏性方法，提供个体的分子标签。作为特定分类元的独立鉴定方法，MALDI-TOF、FT-ICR-MS和拉曼光谱术是细菌多相表征的辅助工具。

3.基因组学和宏基因组学对原核生物分类和系统学的影响

典型菌株的基因组测序促进了原核生物系统学的发展，解决了更高分类元系统发育的很多歧义。基因组序列作为确定原核生物分类元的“典型材料”，将促进对很多生长要求苛刻的和未培养的微生物，以及很有生物学价值的内共生体的分类和系统学研究。

截至2014年，已有3600种典型原核生物菌株的完整基因组序列或草图释放到公共数据库（GenBank、EMBL等）。可通过基因组比较描述原核生物种和新种、更改分类元、鉴定分类群的功能特性。基因组比较包括基因成分和基因顺序分析、系统发育分析、核苷酸组成和代谢途径反应成分分析等。从菌落群体或单细胞获得的基因组序列可作为典型材料；如果无法获得基因组序列（如专性内共生体），可选择采用多座位序列分析。然而，很多紧密相关但非同一菌株来源的宏基因组或其他基因组序列，不适合作典型材料。对于基因组序列，必须显示DNA样本存储的不同国家至少2个公共保藏中心的编号。典型菌株的基因组草图序列要大于30倍覆盖率。对小于5Mb的基因组，序列重叠群的数量要小于150。对大的基因组，序列重叠群的数量要小于400。要尽量详细记录分离菌株原始标本的基本信息，如地理位置（经纬度）、采集时间和日期、深度或高度以及其他特殊条件；也要记载微生物的基本特性，如菌体生长的温度、pH和盐度范围及最适值，最适条件下的倍增时间，与氧气、碳源和末端电子受体的关系，细胞形状，运动性，形成内生孢子或其他休眠细胞的能力等。