淋巴管酶组织化学的染色方法，首先是配制作用液，在5′-Nase-ALPase双重染色法中需要配制作用液Ⅰ和Ⅱ。

作用液Ⅰ按以下试剂和剂量进行配制：0.2mol/L Tris-顺丁烯二酸缓冲液20ml，腺苷-5′-磷酸钠（5′-AMP）20mg，0.1mol/L硫酸镁5ml，蔗糖3g～4g，蒸馏水22ml，2%硝酸铅3ml，最终pH 7.2。

作用液Ⅱ含有：萘酚AS-B1磷酸钠40mg，溶解于DMF（N，N-dimethyformamide）2ml，0.1ml Tris盐酸缓冲液（pH 9.2）40ml，固蓝BB（Fast blue BB）40mg。

作用液中的腺苷-5′-磷酸钠和萘酚AS-B1磷酸钠为作用底物，硫酸镁为酶的激活剂，硝酸铅为反应产物的捕捉剂。

为保持酶的活性，实验的组织材料应快速置于液氮中冷冻，在低温冰箱中（−40℃）保存。染色前将实验的组织块制作冷冻切片，切片厚15～20μm，吹干后置入反应液Ⅰ内，在温箱中（37℃）孵育30～60分钟后，用0.1mol/L二甲砷酸缓冲液漂洗3次，再入0.5%～1%硫化铵液内1～2分钟，见切片呈现黑褐色立即取出，蒸馏水洗3次，再将切片置入反应液Ⅱ内孵育60～90分钟，蒸馏水洗，甘油明胶封片，光镜下观察结果。经双重染色处理的切片在光镜下毛细淋巴管和淋巴管呈棕色或棕黑色，而毛细血管和血管则呈蓝色。

因酶组织化学技术具有高度的特异性，又有一定的灵敏性，染色时需借助阴性对照和阳性对照，以证实染色结果的客观性。

为证实待染色的组织切片确实含有5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶，先取若干样片在60℃温箱中放置60分钟，使酶受到破坏，再按前述的染色过程染色，结果应为阴性，从而证明组织内含有这两种酶，然后再进行实验组切片的染色、观察。

在实验组切片的染色中首先行阴性对照实验，即去除作用液的腺苷-5′-磷酸钠和萘酚AS-B1磷酸钠底物，染色结果应为阴性，从而排除了底物外的其他试剂引起的假阳性的可能。

在染色中同时行抑制实验的对照，即在作用液Ⅰ中加入左旋咪唑（L-tetramisole）5mmol/L，用以抑制碱性磷酸酶，在作用液Ⅱ中加入NiCl ₂ 50mmol/L，用以抑制5′-核苷酸酶。此抑制实验无需双重染色，切片分别在两种作用液中孵育，但条件应与实验组相同。结果观察时与相邻的实验组染色切片比较，以明确酶表达的部位。