目前，实体瘤中干细胞的分离和鉴定与其说是科学，更像是一个艺术。它需要以下支持：①细胞悬液制备，常常用蛋白水解酶；②细胞分离，基于细胞表面标志或荧光染料排除实验；③分离细胞接种到免疫缺陷鼠观察是否瘤体形成。实际上，这些技术用在实体瘤上尚存在许多困难。

一个瘤体并不是一包肿瘤细胞，它包含着肿瘤细胞和各种正常细胞、血管和胞外基质。这些微环境对肿瘤细胞的基因表达，包括细胞表面标志都有很大影响。细胞悬液的制备将破坏这种环境，而移植后也不能再现原有的环境。这样不可能有适宜肿瘤干细胞生长的“巢”环境。

细胞分离基于表面标志物的有无。在乳腺癌干细胞的研究中，表面标志（CD44 ^＋，CD24 ^－，ESA ^＋）似乎并不能代表干细胞，更多的是分化类型特征。干细胞中这些标志物的缺失比表达更有意义。细胞悬液的准备中，酶处理可改变细胞表面标志的表达，从而影响分离的细胞群，甚至移植后早期肿瘤的生长。

另一个细胞分离的方法是通过荧光染料排除实验鉴定出所谓的“侧亚群”细胞。这种方法也有疑问。这个技术影响因素多，需要根据不同的细胞群调节。另外，荧光染料本身也可能有细胞毒性，影响到侧亚群细胞的形成。

而测试一个肿瘤细胞是否能再生成一个肿瘤并非易事。这依赖于干细胞所处的环境。移植细胞的一个功能是产生刺激细胞存活和增殖的因子。如果移植前细胞悬液中混入基质可增加移植成功率。因此，移植的纯化“肿瘤干细胞”可能是自身能分泌存活因子的细胞，或者能从周围环境中获得刺激因子的细胞，而并非有干细胞的特性。