白血病是一种造血系统恶性肿瘤,是造血干细胞克隆性疾病,是一组高度异质性的恶性血液病,其特点为白血病细胞异常增生、分化成熟障碍,并伴有凋亡减少。细胞成熟障碍阻滞发生在较早阶段称为急性白血病(acute leukemia, AL)。白血病细胞有明显质和量的异常,使正常造血功能受抑制,并在骨髓、肝、脾、淋巴结等各脏器广泛浸润,外周血红细胞和血小板数减少,临床上出现不同程度的贫血、出血、发热、胸骨压痛、感染和浸润等症状,可危及生命。

实验室分析路径见图2-7。

从基本的细胞计数、细胞形态观察,到细胞化学染色,再到遗传学染色体分析、分子水平基因检测,白血病的实验诊断项目多,方法、技术涉及面广,其目的旨在帮助正确的诊断、分型,并有助于治疗和预后判断。

主要了解外周血中红细胞、血红蛋白、白细胞和血小板的结果与水平。如果出现原始细胞或异常细胞,血细胞分析仪会出现提示或报警,此时需用显微镜进行确认和分类。

重点观察有核细胞增生程度、有无和多少原始细胞,根据形态特征判断细胞属性和分类计数。原始细胞比例是白血病分类的诊断条件之一。

血细胞所含的POX主要为髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) , MPO是人类中性粒细胞含量最多的一种蛋白质。依染料色素原使用的不同, POX染色方法有多种, ICSH推荐三种:二氨基联苯胺法、过氧化物酶氨基-甲基卡巴唑染色法和二盐酸联苯胺法。其染色基本原理为:血细胞内的POX,能分解H ₂O ₂而释放出新生氧,后者氧化色素原,形成不溶性的有色沉淀,定位于POX酶所在的活性部位。POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型最重要的、首选的细胞化学染色,见表2-3。

血细胞中的NAS-DCE水解基质氯乙酸AS-D萘酚,产生AS-D萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶所在的部位。NAS-DCE是急性白血病的常规细胞化学染色,主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型,急性早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞呈强阳性,其他反应见表2-3。

NAS-DAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中,是一种中性非特异性酯酶。血细胞内的NAS-DAE在pH中性的条件下水解基质醋酸AS-D萘酚,释放出ASD萘酚,进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质内酶活性所在部位。一般情况下,须同时做氟化钠抑制试验。NAS-DAE染色主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型,急性单核细胞白血病中细胞大多数呈阳性且程度较强,阳性反应能被氟化钠抑制。其他反应见表2-3。

过碘酸是氧化剂,使含有乙二醇基的多糖类物质(糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等)氧化,形成双醛基。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合,使无色的品红变成紫红色化合物,定位于含有多糖类的细胞内。PAS主要可用于辅助鉴别急性白血病细胞类型,急性淋巴细胞白血病时原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞的阳性率升高,呈粗颗粒状或弥散分布,其他反应见表2-3。另外PAS还用于判断红细胞系统疾病,红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中的有核红细胞可呈阳性,为均匀红色或块状阳性。

白血病细胞的表面上有大量的蛋白抗原,可以用单克隆抗体来识别。这些抗原和抗体系根据分化群(CD)号码来区别。由于CD抗原表达于特定系列不同发育阶段的细胞上,其在细胞表面上的获得和丢失在一定程度上反映细胞分化程度和功能状态,因此可以利用单克隆抗体检测相应白细胞表面抗原或胞质内的分化抗原进行白血病类型、细胞发育阶段的鉴别,从而有助于白血病诊断与鉴别,并指导治疗和判断预后。目前常采用流式细胞技术来达到识别CD抗原的检测目的。

其目的是寻找和发现染色体异常、基因异常,对急性白血病的诊断、治疗和预后判断有重要作用。在有条件的实验室,所有急性白血病都应做细胞遗传学分析。

对于白血病的实验诊断,原则上不应该区分首选实验和次选实验,只是由于某些实验需要较先进仪器设备和特殊试剂,一般基层医院不能开展,因此血细胞分析、血涂片镜检、骨髓象检查和细胞化学检查成为最基本的实验,其他实验根据条件和临床需要尽可能多做。

多数患者白细胞增高,可达100×10 ⁹/L或更高,部分患者白细胞数正常或减低。贫血,红细胞和血小板进行性减低。血涂片镜检发现较多原始及幼稚细胞,有时也可见有核红细胞。

是诊断急性白血病的主要依据。骨髓增生明显活跃或极度活跃,原始细胞增高,形态异常。细胞大小不等,圆形或类圆形,胞核大,部分可见形态不规则,呈扭曲、折叠、凹陷、切迹、双核等;核染色质细致或粗糙,核仁明显,数量不等1～4个;胞质量少,可见空泡。如果发现Auer小体对AML诊断意义重大。正常幼红细胞和巨核细胞比例减低,散在血小板少见或难见。

以细胞分化途径和分化程度为基础的FAB分型,目前仍是白血病分型诊断的最主要依据。分型标准见表2-4。

急性白血病FAB分型以原始和(或)幼稚细胞增生为主,若仅凭瑞氏染色下的细胞形态做出诊断,容易做出错误的判断,而加做细胞化学染色可以提高诊断正确率。过氧化物酶染色(POX )、过碘酸雪夫反应(PAS)、酯酶染色(如氯乙酸AS-D萘酚酯酶, NAS-DCE)、酯酶氟化钠抑制试验等都是辅助诊断急性白血病常做的细胞化学染色项目。其分析诊断思路见图2-8。

运用流式细胞技术和仪器针对细胞表面抗原的单克隆抗体进行检测,确定白血病细胞的免疫表型。现已广泛用于鉴别急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL ) ,见表2-5单克隆抗体鉴别AML和ALL,同时可以明确诊断M ₀、M ₆和M ₇,见表2-6 AML亚型的免疫表型谱。完全依据细胞表型标记确定原始白血病细胞来源系列几乎不可能,因为有时一种白血病细胞表面会出现表达一种以上细胞系标记的表达异常,这与反映细胞克隆的异常基因表达或一种早期未定向祖细胞的异常成熟有关。此外,少部分急性白血病在表型上表现为有两种截然不同的白血病细胞群存在,即双克隆白血病。最常见的这些细胞群表达B淋巴系和髓系标记,常伴有高频率的 t( 9; 22) (q34; q11) ,即Ph 染色体。

染色体遗传学分析有助于某些白血病的诊断和分型。常规显带技术可在50%～80%的AML中发现克隆性染色体异常,约75%的急性淋巴细胞白血病发现染色体数目和结构异常。在AML中最常见的异常是+8、-7和-5,而染色体易位、缺失、倒位则是常见的结构异常,例如 t( 8; 21) (q22; q22)常见于AML-M ₂, t( 15; 17) (q22; q12)目前仅见于AML-M ₃。检测AML的染色体易位和缺失,能提供独立的预后信息。“低危”遗传因素包括:① t( 8; 21) (q22; q22) ,② t( 15; 17) (q22; q12) ,此类患者对治疗反应良好,缓解期较长。“中危”遗传因素包括:①正常染色体组型,②+8,③异常11q23,④其他,如de l( 9q) , +6, +21, +22, -Y等。“高危”遗传因素包括:①-5/de l( 5q) ,②-7/de l( 7q) ,③复杂染色体组型,④其他如 t( 6; 9) (p23; q34) , t( 3; 3) (q21; q96) , 20q, 21q等。FAB分类在细胞形态学与基因和临床特点的相关性上有一定欠缺, WHO提出的新分类标准,结合形态学、遗传学和临床特点将AML分为不同的有各自特点的临床和生物学亚型。有代表性的特点是: WHO分类中把诊断AML的骨髓原始细胞数从30%降为了20%,同时,如果患者染色体发生了如 t( 8; 21) (q22; q22)、inv ( 16) (p13q22)、 t( 16; 16) (p13; q22)、 t( 15; 17) (q22; q12)、11q23克隆性异常,则无论原始细胞数多少都将其诊断的AML,并统一归为急性髓系白血病伴重现性遗传学异常(acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities)。本组疾病以重现性遗传学异常为特征,主要表现为平衡易位,完全缓解率高,预后较好。

血液疾病的基因检测和分析对急性白血病诊断、分型、治疗、判断预后和微小残留灶检测等方面有重要意义,目前应用最广泛的是慢性粒细胞(CML) BCR/ABL融合基因的检测和急性早幼粒细胞白血病(APL) PML-RARα融合基因的检测。目前临床实验室列于检测项目与急性白血病相关的基因见表2-7。