第二部分 禽 病

高致病性禽流感诊断技术 （GB/T 18936—2003）

1 范围

本标准规定了高致病性禽流感（HPAI）病毒分离与鉴定技术、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验、琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验、酶联免疫吸附试验（间接ELISA）的技术要求。

本标准所规定的高致病性禽流感病毒分离与鉴定技术适用于各种禽类高致病性禽流感的病原分离和鉴定；AGID和间接ELISA适用于A型禽流感病毒的型特异性检验；HA-HI试验适用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定。

2 病毒分离和鉴定技术

2.1 材料准备

2.1.1 病料的采集：死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理；活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是以采集气管拭子更好；小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。

2.1.2 病料的保存：病料应放在含有抗生素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内（无PBS可用25%～50%的甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2 000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）和制霉菌素（1 000IU/mL），但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温放置1h～2h后样品应尽快处理，没有条件的可在4℃存放几天，也可于低温条件下保存（-70℃贮存最好）。

2.1.3 病料的处理：将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子；粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.0～7.4的等渗PBS溶液配成10%～20%（g/mL）的悬液。样品液经1 000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。

2.2 病毒分离

2.2.1 样品接种：取处理好的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于35℃～37℃孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。2.2.2 病毒收获：无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应说明可能有正黏病毒科的流感病毒；若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2代，若呈阴性反应，则认为病毒分离阴性。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 A型流感病毒的型特异性鉴定：样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）制成抗原，与A型禽流感病毒标准阳性血清进行AGID试验，检测样品中是否含有A型流感病毒。

2.3.1.1 抗原制备：从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2的PBS冲洗后，将CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反复冻融3次～4次，以1 000r/min离心10min后取上清，按终浓度为0.1%的量加入甲醛溶液。置37℃温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中含有A型禽流感病毒。

2.3.1.2 AGID试验方法：按本标准第4章中的方法进行。

2.3.2 血凝素亚型鉴定：当鸡胚尿囊液具有血凝活性时，首先应排除血凝活性是否由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。鸡胚尿囊液具有血凝活性或证明含有A型流感病毒存在后，采用HA-HI试验方法（按本标准第3章中的方法进行），用禽流感病毒15种血凝素（H1～H15）亚型分型血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。

2.4 致病性测定

禽流感病毒致病性测定应在具有高度生物安全性的实验室中进行，有以下两种方法，任选其一。

2.4.1 静脉接种致病指数（IVPI）测定法

2.4.1.1 试验鸡：6周龄SPF鸡，10只。

2.4.1.2 接种材料：感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。

2.4.1.3 接种方法：将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1：10稀释，以0.1mL/羽的剂量翅静脉接种。

2.4.1.4 每日观察每只鸡的发病及死亡情况，连续观察10d，计算IVPI值。计算方法参见附录A。

2.4.1.5 判定标准：当IVPI值大于1.2时，判定此分离株为高致病性禽流感（HPAI）病毒株。

2.4.2 致死比例测定法

2.4.2.1 试验鸡：4周龄～8周龄SPF鸡，8只。

2.4.2.2 接种材料：感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。

2.4.2.3 接种方法：将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1﹕10稀释，以0.2mL/羽的剂量翅静脉接种。每日观察鸡的死亡情况，连续观察10d。

2.4.2.4 判定方法

2.4.2.4.1 接种10d内，能导致6只～7只或8只鸡死亡，判定该毒株为高致病性禽流感病毒株。

2.4.2.4.2 分离物能使1只～5只鸡致死，但病毒不是H5或H7亚型，则应进行下列试验：将病毒接种于细胞培养物上，观察其在胰蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。

2.4.2.4.3 对低致病性的所有H5或H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关的肽链的氨基酸序列分析，如果分析结果同其他高致病性流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。

3 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术

3.1 材料准备

3.1.1 96孔V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。

3.1.2 阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。

3.1.3 pH7.2、0.01mol/L PBS。

3.1.4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。

3.2 操作方法

3.2.1 血凝（HA）试验（微量法）

3.2.1.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

3.2.1.2 吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第1孔，混匀。

3.2.1.3 从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。

3.2.1.4 每孔再加入0.025mL PBS。

3.2.1.5 每孔均加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。

3.2.1.6 振荡混匀，在室温（20℃～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

3.2.1.7 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。

3.2.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）

3.2.2.1 根据3.2.1试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1﹕256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1﹕64（256除以4）。

3.2.2.2 在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。

3.2.2.3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

3.2.2.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。

3.2.2.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。

3.3 结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于5log2为阳性。

4 琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验

4.1 材料准备

4.1.1 硫柳汞溶液、pH7.2、0.01mol/L PBS溶液，配制方法见附录C。

4.1.2 琼脂板：制备方法见附录D。

4.1.3 禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。

4.2 操作方法

4.2.1 打孔：在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm，孔距2mm～5mm，将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。

4.2.2 封底：用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。

4.2.3 加样：用微量移液器或带有6～7号针头的0.25mL注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔（图1的⑦号），标准阳性血清分别加入外周的①和④孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔（图1的②，③，⑤，⑥号孔）。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。

4.2.4 作用：加样完毕后，静置5min～10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。

4.3 结果判定

4.3.1 判定方法

将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清（图1的①和④号孔）与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。

4.3.2 判定标准

4.3.2.1 若被检血清（如图1中的②号孔）与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。

4.3.2.2 若被检血清（如图1中的③号孔）与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清（如图1中④号孔）的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性）。

4.3.2.3 若被检血清（如图1中的⑤号孔）孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。

4.3.2. 4 若被检血清（图1中的⑥号孔）与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。

5 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）

5.1 材料准备

5.1.1 酶标板、加样器（带滴头），酶标测定仪。

5.1.2 使用溶液的配制：方法见附录E。

5.1.3 间接ELISA抗原，间接ELISA酶标抗体。

5.1.4 抗原包被板制备：方法见附录F。

5.2 操作步骤

5.2.1 样品准备：将被检血清用稀释液（见附录E.5）做1﹕400稀释。

5.2.2 加样：取出抗原包被板，倒掉孔内包被液，用洗液洗3次。除A1、B1、C1和D1孔不加样品，留作空白调零，阴性血清和阳性血清做对照各占1孔外，其余孔加1﹕400稀释的被检血清，每孔100μL ，将加样位置做好记录，将反应板盖好盖子后置37℃环境下作用30min。

5.2.3 洗涤：倒掉孔内液体，在吸水纸上控干，每孔加满洗液，静置1min～2min后倒掉，控干，再重复洗2次。

5.2.4 加酶标抗体：除A1、B1、C1和D1孔外，其他每孔加酶标抗体液100μL ，盖好盖子后置37℃环境下作用30min。

5.2.5 洗涤：洗涤方法同5.2.3。

5.2.6 加底物：加底物使用液（见附录E.6），每孔90μL ，置室温避光显色2min～3min。

5.2.7 终止：加中止液（见附录E.8），每孔90μL ，使其终止反应。

5.3 结果判定

用酶标仪测定每个孔在490nm波长的光密度值（即OD值），OD ≥0.2者判为阳性，0.18≤OD＜0.2需重复测试1次，若仍在此范围则判为阳性，OD＜0.18者判定为阴性。

附录A

（资料性附录）

高致病性禽流感病毒IVPI测定计算方法

A.1 记录方法

根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3（病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现。一般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观察都记为3）。

A.2 IVPI值计算

IVPI值计算见式（A.1）。

如指数为3.00，说明所有鸡24h内死亡；指数为0.00，说明10d观察期内没有鸡表现临床症状。

列举一个假设试验来说明IVPI的计算方法见表A.1。

附录B

（规范性附录）

HA和HI试验用溶液的配制

B.1 阿氏（Alsevers）液配制

葡萄糖 2.05g

柠檬酸钠 0.8g

柠檬酸 0.055g

氯化钠 0.42g

加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa、15min高压灭菌，4℃保存备用。

B.2 1%鸡红细胞悬液制备

采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH 7.2、0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1 000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%的鸡红细胞悬液，4℃保存备用。

附录C

（规范性附录）

AGP试验用溶液的配制

C.1 1%硫柳汞溶液的配制

硫柳汞 1.0g

加蒸馏水至 100mL

溶解后，置100mL瓶中盖塞存放备用。

C.2 pH7.2、0.01mol/L PBS的配制

a） 配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL。

b） 配制1×PBS：量取40mL 25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1 000mL。

c） 用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.2.

d） 灭菌或过滤。

e）PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。

附录D

（规范性附录）

琼脂板的制备

称量琼脂糖1.0g，加入100mL的pH7.2、0.01mol/L PBS液中在水浴中煮沸充分溶化，加入8g氯化钠，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL。冷至45℃～50℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL～20mL，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。

附录E

（规范性附录）

高致病性禽流感间接ELISA使用溶液的配制

E.1 碳酸盐缓冲液（0.05mol/L、pH9.6，CBS）

碳酸钠 1.59g

碳酸氢钠 2.93g

用双蒸水溶解至1 000mL，于4℃保存，不超过1个月。

E.2磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）

氯化钠 8g

磷酸二氢钠 0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.9g

氯化钾 0.2g

加蒸馏水至 1 000mL

E.3洗液（含0.05%Tween-20的0.01mol/L，pH 7.4的PBS，即PBST）

Tween-20 0.5mL

加0.01mol/L、 pH7.4的PBS 1 000mL

E.4封闭液（含0.5%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA） 0.5g

加洗液至 100mL

4℃存放，避光

E.5稀释液（含0.1%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA） 0.1g

加洗液至 100mL

4℃存放，避光。

E.6间接ELISA底物缓冲液（磷酸氢二钠-柠椒酸，pH5.4）

0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HP04·12H2O） 26.7mL

0.1mol/L柠檬酸 24.3mL

双蒸水 49mL

准确称量40mg邻苯二胺（OPD），溶解后置暗处保存，临用前加入30%过氧化氢150μL 。

用时现配，避光。

E.7三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCI）缓冲液（0.05mol/L、pH7.6）

0.1mol/L Tris 250mL

0.1mol/L盐酸 192.5mL

双蒸水 57.5mL

E.8间接ELISA终止液

浓硫酸 11.1mL

蒸馏水 88.9mL

附录F

（规范性附录）

高致病性禽流感间接ELISA抗原包被板制备

抗原包被板也称诊断板，将高致病性禽流感抗原用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（见附录第E.1章）稀释成3μg/mL（全病毒抗原）或6μg/mL（重组核蛋白抗原），包被40孔聚苯乙烯微量板，每孔100μL ，置4℃冰箱过夜，用洗液洗涤（见附录第E.3章）3次，用封闭液（见附录第E.4章）于37℃湿盒内封闭60min，用洗涤液洗涤3次，干燥后即为诊断板，置4℃冰箱备用。