自从1898年Coley第一次使用细菌产品治疗肿瘤开启了肿瘤免疫治疗的篇章以来，肿瘤免疫治疗经历了狂热-质疑-复兴的螺旋上升式发展，直到2011年第一个免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）——BMS公司的细胞毒T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）单抗Ipilimumab获批恶性黑色素瘤适应证开启了肿瘤免疫治疗全新的时代。目前以针对程序性死亡受体-1及其配体（PD-1/PD-L1）单抗为代表的ICIs，在各个癌种进行临床试验相继取得成功而获得批准上市，以其持续缓解时间长，副反应轻微等特点成为抗肿瘤新药研发的焦点，为攻克肿瘤带来曙光。目前PD-1/PD-L1单抗的研发如火如荼，在国内获得批准上市的PD-1单抗药物就有5个，此外还有大量的ICIs药物处于临床研究的各个阶段。目前ICIs在美国、欧洲和中国获批的适应证包括恶性黑色素瘤（MM），非小细胞肺癌（NSCLC），肾癌（RCC），霍奇金淋巴瘤（HL）等癌种的适应证。

尽管ICIs在多个癌种取得了良好的疗效，被称为“广谱的抗癌药”，但是有效率并不高，在大多数癌种徘徊于10%～30%，而如何筛选对ICIs有效的患者仍处于探索阶段，也是目前肿瘤免疫治疗的重要领域之一。本综述将回顾目前ICIs有效性标志物的研究现状，从抗肿瘤免疫机制上探讨可能标志物探索的方向及目前的研究进展。

在精准医疗时代，ICIs治疗自诞生之初就一直伴随着标志物的探索，在多项临床试验中也加入了标志物的筛选和探索，本部分将综述目前研究相对集中和成熟的ICIs疗效标志物的研究现状及存在的挑战。

由于PD-1/PD-L1的结合是ICIs的直接作用靶点，因此通过免疫组化（IHC）检测肿瘤细胞或肿瘤微环境中PD-L1的表达成为目前临床上最常用的ICIs治疗应答预测标志物。在NSCLC的二线治疗临床试验中，PD-L1的表达与ICIs治疗的应答率及生存具有一定的相关性，因此在一线治疗的临床试验中，PD-L1表达就成为富集ICIs治疗有效人群的重要标志物。在CheckMate-026研究中，PD-L1≥5%的人群中，Nivolumab的治疗并未在总体上体现出明显的获益，但在富集PD-L1≥50%的人群的Keynote-024研究中，Pembrolizumab则较化疗显示出更好的客观缓解率以及生存获益，两项研究对比也提示PD-L1表达越高，ICIs获益的可能性也越大。然而在NSCLC的其他研究中，PD-L1作为标志物的价值仍存在争议。在一项在早期NSCLC使用Nivolumab进行新辅助治疗的临床试验中，PD-L1的表达与ICIs治疗后主要病理缓解（MPR）并无显著相关性，这一结果强烈提示PD-L1表达很可能并非预测ICIs生存获益最理想的标志物。而在肺癌以外的其他肿瘤，包括MM、RCC及尿路上皮癌中，PD-L1对ICIs疗效预测价值也存在争议。

PD-L1作为ICIs疗效预测的不一致性，可能与以下因素有关：①PD-L1表达调控复杂性：PD-L1的表达分为组成性固有表达和适应性表达，组成性表达可由一些致癌基因信号通路（如PI3K-AKT）激活或某些染色体异常造成，在肿瘤组织中广泛而稳定的表达；而适应性表达则主要由与肿瘤细胞接触的T淋巴细胞释放的致炎因子，如干扰素-γ（IFN-γ）等诱导产生，随着免疫微环境变化而出现较大改变。很显然，只有具有适应性表达的PD-L1的肿瘤才能对ICIs治疗具有良好的应答，因此，仅仅用PD-L1表达阳性来区分免疫微环境状态未免过于简单。②PD-L1表达的时空异质性：由于适应性表达的PD-L1可能是局灶性或聚焦分布，加之前序的抗肿瘤治疗很可能对PD-L1的表达产生较大影响，因此肿瘤组织内PD-L1表达的时空异质性很明显，单一时间点检测或者细针活检很可能无法真实反映肿瘤组织的PD-L1表达状态。③PD-L1检测抗体的差异性：由于目前用于商业化诊断的抗体针对不同的PD-L1表位，而这些表位在石蜡组织中稳定性不一，且这些抗体的亲和力、特异性均有差异，其判断结果不能同等转换。④PD-L1检测定量主观性：IHC并非蛋白定量检测的方法，其结果判读具有一定的主观性，亦使其结果用于指导临床治疗带来困难。

DNA错配修复（MMR）是一种关键的DNA修复机制，用于识别和修复DNA复制和重组过程中可能发生的错误的碱基的掺入、缺失和插入。错配修复缺陷（dMMR）往往会导致细胞内突变的累积，特别是短片段重复序列DNA长度变异增大，即微卫星不稳定性（MSI）。这两种表型都会造成大量DNA突变负荷，使肿瘤的免疫原性显著增强，因此推测dMMR/MSI可能与ICIs治疗疗效相关。最早在结直肠癌（CRC）中的Keynote-016研究发现，具有MSI表型的CRC患者对Pembrolizumab治疗具有良好的应答（ORR 52%），而微卫星稳定型（MSS）的CRC患者则几乎对治疗不应答（ORR 0）。而在具有MSI表型的其他非CRC实体瘤患者中，具有类似的高应答率（ORR 54%），而FDA也根据这些结果批准了第一个ICIs泛癌种的适应证。而后Nivolumab的一系列临床研究亦印证了具有dMMR/MSI的患者是ICIs的优势人群，而联合CTLA-4单抗则可能进一步改善治疗应答和生存。尽管大多数情况，dMMR和MSI都具有相同的生物学特征，但两者也有可能出现不一致的情况，研究表明，dMMR与MSI同时检测有助于提高检测的准确率并做出更好的临床决策。

dMMR或MSI只是部分特征性表型，而真正决定ICIs应答的很可能是更为深层的分子机制，即肿瘤的突变负荷（TMB）或者新抗原负荷（TNB）。Chan课题组回顾多个临床研究的数据发现，TMB/TNB高的患者有更多可能性获得持续临床获益（DCB），其PFS以及ORR也明显升高。CheckMate-026研究回顾性分析也提示，TMB-H（突变数量>243）的患者具有更好的ORR和PFS，如果同时合并PD-L1高表达，则可能是ICIs单药治疗的最适宜人群。除了NSCLC，在泛癌种的分析中也发现，TMB与ICIs治疗疗效之间亦存在较好的相关性，提示TMB很可能是一个ICIs疗效的预测标志物，需要开展前瞻性研究进行深入探索。而在目前唯一将TMB纳入研究终点分析的CheckMate-227研究中，尽管再次证实TMB-H的患者接受二联ICIs（Nivolumab + Ipilimumab）治疗获得更高的ORR和PFS，但OS却没有显著差异，提示TMB可能无法反映ICIs治疗的预后。

TMB作为ICIs的预测标志物仍有较多的问题需要进一步探索。①TMB检测方法一致性差：作为金标准的全外显子组测序（WES）需要消耗较多的样本，在晚期肿瘤患者中检测有困难，而采用基因panel的方法检测并预估TMB，由于抽样基因不一，存在panel间预测值差异较大。近来本课题组研究提示测序的数据量可能比基因数量更能反映TMB水平。②TMB cut-off值不确定：WES与panel检测的cut-off值计算方式不一样，而各个癌种由于发病机制不同，cut-off值的选取也有可能存在差异，因此，需要更大规模的基于癌种和基于WES的研究确定cut-off值。③TMB不能完全反映免疫原性：真正决定ICIs治疗反应的是肿瘤细胞含有新抗原的数量（TNB），及其通过MHC Ⅰ类分子（～10 ²⁰种组合）呈递后与T细胞表面TCR（通过V（D）J重排可产生～10 ⁸种组合）结合的反应全过程，因此单方面检测TMB并不一定能完全反映抗肿瘤免疫原性。同时没有检测突变抗原表达的情况下，TMB与真实的体内免疫反应就存在更多的不确定性。④单点检测TMB意义有限：有研究发现，克隆新抗原多的患者对CTLA-4和PD-1检查点抑制剂均表现出良好的应答。然而，亚克隆新抗原多的患者并没有从治疗中获益。这些发现表明，如果大多数突变是亚克隆的，高非同义突变可能不能预测治疗的反应。而本课题组研究发现单点取样的TMB检测难以反映整体免疫状态。

由于ICIs作用靶点是肿瘤-免疫微环境，因此针对肿瘤微环境（TME）中标志物的探索自ICIs临床应用以来从未停歇。肿瘤免疫微环境中对ICIs治疗有三个重要影响因素：肿瘤细胞和免疫细胞的组成、定位和功能，三者相互影响，效应细胞和抑制细胞相对比例、免疫细胞和肿瘤细胞的相对定位和免疫效应细胞的激活和耗竭状态。TME可根据PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞浸润（TIL）状态分为四型：Ⅰ型（TIL-PD-L1-）：ICIs治疗靶点缺失型；Ⅱ型（TIL+ PD-L1+）：ICIs治疗靶点适应型；Ⅲ型（TIL+ PD-L1-）：ICIs治疗靶点部分缺失型和Ⅳ型（TILPD-L1+）：ICIs治疗靶点部分缺失型。通过对46例MM患者进行回顾性分析发现，TIL的数量以及肿瘤浸润边界的CD8+TIL密度可以很好预测MM患者的ICIs治疗响应，而进一步细分肿瘤组织中浸润的CD8+ T细胞亚群，可以发现同时具有PD-1高表达/CTLA-4高表达浸润的CD8+T细胞的MM患者具有更好的ICIs应答率和PFS，而这部分TIL具有部分耗竭T细胞的特征；但新近研究发现，记忆性T细胞特征基因表达上调（如IL7R，TCF7，REL，FOXP1，FOSL2和STAT4）的恶性黑色素瘤患者较具有耗竭型T细胞特征基因表达上调的（CD38，HAVCR2，ENTPD1，PDCD1，BATF，LAG3，CTLA4和PTPN6）的患者，对ICIs治疗具有更好的应答。这些不一致的发现提示对于肿瘤免疫微环境的复杂性仍然需要更进一步探索，可能更多的免疫细胞，包括抑制性免疫细胞，比如调节性T细胞（Treg），髓源性抑制细胞（MDSC）以及M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等。

TME中的促炎因子，在肿瘤微环境调节中发挥了重要的作用，是TME中值得关注的标志物。其中IFN家族是最为重要的促炎因子，不但能激活免疫细胞，还可以增加肿瘤细胞上MHC-I的表达，从而提高CD8+ T细胞识别和杀伤效应，因此有研究利用IFN基因印记来选择合适的肿瘤进行免疫治疗。回顾性分析发现，具有IFN-γ基因mRNA表达特征谱（GEP）的肿瘤患者（9个癌种）可以预测接受Pembrolizumab的应答和临床获益，而CheckMate-275也证实具有IFN-γ GEP的尿路上皮癌患者对Nivolumab具有更好的临床获益。这些研究也发现，在炎症性肿瘤中一些免疫抑制因子，如IDO和LAG-3亦出现高表达，因此使用IDO和LAG-3抑制剂可能增加ICIs的疗效。目前，T细胞炎性GEP目前作为前瞻性临床试验的探索性指标正在进行广泛研究，但各药厂开发的GEP所覆盖的基因谱有较大差异，GEP的最佳组合仍需要大规模数据的确证。

无论是从细胞成分还是促炎因子成分去分析TME与ICIs的应答的相关性都存在一定的局限性，考虑到TME的复杂性，在今后可能需要多组学技术更全面的去进行肿瘤免疫微环境的状态，以期能更精准的预测ICIs的获益，并期望找到TME中限制ICIs应答的关键因素，为个体化联合治疗提供指导。通过对TCGA数据库中33个癌种超过10 000例实体瘤，RNA-seq，miRNA-seq，DNA拷贝数，基因突变，甲基化，研究了肿瘤分型-体细胞突变-免疫调节剂复杂的调控网络，分为6种免疫亚型（C1-C6），并提出了影响预后的免疫反应模式理论，为促进免疫治疗的研究提供了启示。

除了TME之外，宿主的免疫状态也会很大程度影响ICIs的应答，其中肠道微生物是研究最集中的领域。对于肠道微生物对肿瘤ICIs治疗疗效影响的关注首先来自于Zitvogel研究团队首次发现小鼠中的拟杆菌属的差异与CTLA-4单抗疗效差异相关，对B.thetaiotaomicron或B.fragilis特异性反应的T细胞与CTLA-4单抗应答相关，而使用广谱抗生素处理过的或无菌饲养的小鼠对CTLA-4单抗则缺乏应答。对249例肺癌、肾癌和膀胱癌患者的数据进行了检测，其中在使用PD-1单抗前应用了抗生素的69例患者，很快出现复发且存活时间较短。在对PD-1单抗应答的患者的粪便中，发现了大量名为A.muciniphila肠道细菌。这种细菌与肠道黏液层相关，可能对肥胖和糖尿病的控制有一定帮助作用。当没有肠道细菌的无菌小鼠接受缓解患者的粪便移植时，这些小鼠对PD-1抑制剂的疗效要优于那些接受了未缓解患者的粪便移植的小鼠，并且这些缓解状况不佳的小鼠在喂养过A.muciniphila后也出现了缓解。而在对MM患者的分析中发现，对ICIs应答的患者粪便内发现大量Ruminococcaceae家族细菌，而其肠道微生物更具多样性。但是也有研究认为特定的肠道菌群可能引发肠道炎症反应并进一步促进肿瘤发生，其机制可能与这些细菌产生的毒素诱导的免疫抑制细胞相关。发现与ICIs应答的正/负向相关肠道菌群不但可以进一步揭示宿主整体免疫在ICIs应答中的机制，还有可能利用精准的肠道菌群移植提高ICIs的临床获益人群，目前多项临床研究已经将ICIs治疗患者粪便样本收集列入标志物探索的策略之一。

目前对于ICIs标志物探索从单一的PD-L1，TMB，dMMR发展为对TME和宿主免疫等状态的整体评估，已经在不同的检测水平发现一些有意义ICIs标志物。

最经典的例子就是具有胚系BRCA1/2基因突变或DNA修复基因突变的患者，具有较高的TMB，而与ICIs的疗效好有关。除此之外，目前已经有研究显示胚系HLA-I异质性可能与患者接受ICIs的不良预后密切相关。MM患者中白介素以及趋化因子相关通路中的基因变异与ICIs的疗效以及毒性有关。此外，胚系突变所致miRNA调控通路的缺陷也与ICIs的疗效以及毒性有关。因此针对抗肿瘤免疫反应相关机制寻找宿主遗传基因缺陷，可能是发现ICIs标志物的可能途径之一。

肿瘤细胞产生的突变可能影响免疫微环境，最为典型的例子就是非同义突变的数量，亦即TMB对免疫原性的改变。但是目前尚不清楚具体哪些基因改变从机制上造成了TMB的升高。王洁课题组发现碱基切除修复、同源重组修复和MMR对TMB升高贡献最大。而DNA修饰基因APOBEC蛋白高表达可能与TMB相关。此外，部分对于肿瘤至关重要的基因亦会对TME及ICIs应答造成重要的影响，例如携带TP53和KRAS突变的肺癌患者，可能具有更高的TMB和PD-L1表达，而对ICIs应答更好。相反，如果同时携带KRAS和STK11突变的肺癌患者，则缺乏对ICIs治疗获益。由于不同的研究结果的不一致性，可能需要更大样本的证实，并从机制上阐明单个或某些通路上多个基因突变与ICIs治疗应答的相关性。而这些发现往往可能发现ICIs治疗应答，严重副反应以及超进展等现象的关键基因，为今后定制肿瘤免疫治疗预测基因检测panel提供重要线索。

ICD是一种可以释放损伤相关的分子模式（DAMPs）并激发保护性免疫的死亡模式，小剂量放化疗以及溶瘤病毒等刺激可以促进ICD，且不同的化疗药物可能促进ICD的效应所差异。ICD也是目前临床选择放化疗联合ICIs的主要作用原理之一，而且也可以解释一些放疗联合ICIs的远隔效应。目前对于ICD的监测标志物主要包括DAMPs的释放（HMGB1，Ⅰ型干扰素等），免疫适应性指标（LDH释放）以及特定的免疫细胞亚群（例如TCR组库测定）。此外，监测全身性免疫炎症指数，例如粒淋比例也是很好的反映ICD的方式。值得注意的是，目前无论是ICIs的试验设计还是临床实践都有联合治疗的倾向，使得能够用于分析单药ICIs标志物的有效样本大大减少，而很显然单药ICIs治疗的患者能更好反映其发挥作用的机制和预测方法。因此，一方面需要鼓励单药ICIs治疗的探索，以便于从ICIs的本质上去探寻标志物，另一方面从ICD机制寻找ICIs联合治疗标志物，可能为临床实践拓展思路。

由于机体免疫状态及肿瘤免疫微环境的复杂性和时空异质性，未来对于ICIs标志物的探索必然是多组学、多角度的，并且能够做到动态实时评估。开发外周血中可以测定的或影像学的标志物，可以实现对ICIs疗效和毒性的实时监测。除了监测全身性免疫炎症指数之外，我们课题组的研究也发现贫血的患者存在大量免疫抑制细胞，可能与ICIs疗效负向相关。血清学标志物，如IL-8，和外周血免疫相关标志物，如使用ELISpot方法检测肿瘤特异性新抗原（MANA）的T细胞激活，都是潜在的ICIs有效的分子标志物。基于循环DNA（ctDNA）测序的血液TMB（bTMB）分析在某些情况下是组织检测的有效补充。功能学影像的动态监测，比如治疗后的PET-CT可能反映肿瘤组织的代谢活性变化，都为实时监测ICIs治疗的反应提供重要依据。

ICIs治疗也会出现获得性耐药，最近的一项研究分析了Pembrolizumab治疗获得性耐药的标本，发现了Janus激酶（JAK）、JAK2以及β-2微球蛋白失活的突变可能是ICIs耐药的原因。另一项研究分析4例ICIs治疗耐药NSCLC患者基线与耐药时样本发现，7/18可能的肿瘤相关新抗原亚克隆在耐药样本中缺失，提示新抗原克隆性缺失致免疫原性减弱是获得性耐药的可能机制之一。在应对越来越多的ICIs的获得性耐药的患者时，对耐药机制的深入了解，不但可以提前预警ICIs的获得性耐药，更能够为后续挽救性治疗提供理论基础。

总体来讲，现有的ICIs标志物远远无法满足精准医疗时代医患的要求，随着对肿瘤免疫学认识的深入和免疫学和各种组学技术的不断发展，ICIs的标志物从原有的对单一集中于肿瘤细胞的标志物，逐渐向肿瘤免疫微环境，乃至宿主的全身免疫状态等多个层面的综合评估。同时，开发基于外周血检测和影像学检测的动态监测标志物也是目前研究的热点领域。而免疫治疗标志物也包含了疗效预测标志物、毒性预测标志物、超进展预测标志物以及获得性耐药标志物，从而对肿瘤免疫治疗的多维度全面评估。未来对于ICIs的探索应当基于免疫学原理，从抗肿瘤免疫的全过程进行深入研究，寻找ICIs治疗的各种标志物。通过高通量多组学的研究，可能化繁为简找到预测TME免疫状态和ICIs治疗有效的关键标志物组合。