自2004年起，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）多项具有里程碑意义的临床研究，改变了NSCLC的临床实践。IPASS研究告诉我们，基于表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）突变而非临床/病理特征的选择，一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）相比化疗，能显著改善EGFR突变患者的疗效，减轻不良反应。随后，二/三代EGFR TKIs相继面世，与一代EGFR TKIs相比，具有更优秀的疗效。针对一/二代EGFR TKIs的获得性耐药进行研究，发现20外显子的T790M突变是其主要耐药机制，三代EGFR TKI奥西替尼已经成为此类患者的标准治疗。而在EGFR基因未发生突变的肺癌患者，临床研究已提示不宜使用靶向药物。所有这些研究有助于NSCLC建立新的分子诊疗模式，强调EGFR基因检测是使用EGFR TKIs治疗的先决条件。本文将重点梳理并讨论目前EGFR基因检测的现状、面临的主要挑战及未来的发展方向。

EGFR是原癌基因C-erbB-1的表达产物，是一种跨膜蛋白。EGFR基因位于第7号染色体短臂上，有28个外显子。其中EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18～21外显子上。EGFR存在常见突变位点，也就是19号外显子的非移码缺失，或21号外显子的L858R错义突变，称之为敏感突变或者经典突变，大约占EGFR突变总数的85%～90%。除去敏感突变，剩余10%～15%左右的基因突变被称作为EGFR少见突变（或者罕见突变），在其中，主要的EGFR突变类型有G719X、L861Q、S768I及20外显子插入突变。有研究报道，在欧洲和北美，10%～20%的肺腺癌患者存在EGFR敏感突变；而在亚裔人群，这个比率高达50%～60%。

2004年10月，FDA基于Ⅲ期临床研究BR.21批准了第一个EGFR TKIS药物厄洛替尼用于至少接受过一线化疗失败的晚期非小细胞肺癌的治疗。尽管早在2004年，基础研究就已经发现EGFR 19外显子缺失突变及EGFR L858R突变可激活EGFR通路，并对EGFR TKIS敏感。但EGFR TKIs早期的临床试验并没有使用生物标记物作为伴随诊断，因此，临床试验的结果并非令人满意。BR.21研究中厄洛替尼的客观缓解率（objective response rate，ORR）仅为8%；对患者的临床特征进行分析发现，不吸烟、女性、东亚人群对治疗的反应相对更好。这启发后来的研究者以临床特征为入组条件评估EGFR TKIs的疗效，如IPASS研究及FIRST-SIGNAL研究；同时探索性分析可能预测EGFR TKIs疗效的生物标志物，如EGFR的蛋白表达（IHC方法）、EGFR拷贝数扩增（FISH方法）以及EGFR的突变。IPASS临床试验始于2006年，在东亚人群中研究吉非替尼对比化疗一线用于不吸烟或既往轻度吸烟的NSCLC患者，1 038例入组患者中有437例具有EGFR突变结果，被用于进行探索性分析。结果发现，在EGFR突变人群中，吉非替尼组的客观缓解率、无进展生存时间（progressionfree survival，PFS）及生活质量均优于化疗；而EGFR野生型亚组，化疗疗效优于吉非替尼；该研究首次在大样本的随机对照研究中证实EGFR突变作为生物标记物具有预测疗效的重要作用。此后，OPTIMAL研究、EURTEC研究、LUX-LUNG 3及LUX-LUNG 6研究等大型Ⅲ期随机对照研究进一步验证了EGFR基因突变是一线EGFR TKIs治疗的重要靶标及关键性的预测标记物。另一方面，一些临床研究及Meta分析显示在EGFR基因未发生突变的肺癌患者，EGFR TKIS并不能降低患者的疾病进展或死亡风险。因此，EGFR基因检测用于指导EGFR TKIs治疗已经成为行业共识及治疗指南。

接受一二代EGFR TKIS治疗的患者在1年左右的获益之后大部分会发生进展，基于二次活检对其耐药机制进行分析发现约一半患者产生了获得性的EGFR T790M突变。三代EGFR TKIS奥希替尼是一种针对T790M突变的药物，且对野生型EGFR抑制效果很弱。2015年，FDA基于AURA及AURA2单臂研究的结果批准了奥希替尼二线用于EGFR TKIS治疗进展且EGFR T790M突变的NSCLC患者。在AURA系列研究中观察到，奥希替尼对具有T790M突变的获得性耐药患者，ORR为61%～71%，中位PFS为9.6～11个月，明显优于含铂双药方案。目前，对于一/二代EGFR TKIS治疗失败的患者，进行EGFR T790M突变的检测已经成为临床常规。

EGFR TKIS对于EGFR少见突变的治疗证据不及敏感突变充分，既往仅有少量临床研究纳入了携带少见突变患者。其中证据较为明确的是阿法替尼对于少见突变中较为常见的几个位点（S768I、L861Q及G719X）具有较好疗效。2015年在Lancet oncology杂志上发表了一项针对阿法替尼一线治疗少见突变的Pool分析研究（LUX-Lung 2、LUX-Lung 3及LUXLung 6研究），阿法替尼治疗G719X、L861Q及S768I突变的ORR分别为77.8%、56.3%及100%，中位PFS分别为13.8个月、8.2个月及14.7个月。因此FDA扩大了阿法替尼治疗的适应证，批准阿法替尼一线用于少见突变的治疗。有大量的案例报道、单中心小队列研究以及回顾性分析显示其他EGFR TKIS药物如吉非替尼、厄洛替尼及奥西替尼对G719X、L861Q及S768I突变同样具有一定疗效。EGFR 20号外显子插入是少见突变中较为常见的类型，但是除A763-Y764insFQEA突变可能对EGFR TKIS敏感之外，其他20号外显子插入突变对目前已上市的EGFR TKIS无效。目前正在研发的新药，如波齐替尼、TAK788已经表现出不错的疗效。除了以上提到的少见EGFR基因突变类型以外，这十年来陆续有个案报道显示一些新的罕见位点的EGFR基因变异能从EGFR TKIs治疗中获益。因此，仅对一个基因的热点区域进行测序，可能会漏检一些可能从TKIS治疗中获益的基因变异。

EGRR突变的本质是单链核苷酸变异（SNVs）或短缺失，这使得人们能够对含有DNA片段的福尔马林固定的小标本进行分子层面的分析。有多种方法可用于检测EGFR突变，早期有传统的Sanger法测序（亦称一代测序）。Sanger法测序在检测等位基因突变时灵敏度在20%左右，这意味着用肿瘤细胞数量较少的样本进行检测可能会有假阴性。随着更敏感的基于聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）的广泛应用，Sanger法测序检测被认为不适合临床应用。目前临床应用的主要检测方法有基于PCR技术的Cobas法及突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法、微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）及基于ddPCR设计的BEAMING（beads，emulsions，amplification，and magnetics）；变性高效液相色谱技术（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）以及高通量测序方法，也称作二代测序（Next-generation sequencing，NGS）等。这些方法在特异性和灵敏度方面有很大差异。ARMS-PCR方法的分析灵敏度在1%左右，ddPCR的灵敏度更高，可以达到0.1%，而高通量测序方法的灵敏度则在2%～6%左右。由于不同检测方法的灵敏度不同，加上检测技术的差异，会导致检测结果的不一致和不可比性。

在EGFR突变人群一线比较厄洛替尼与化疗的Ⅲ期随机对照研究（EURTAC研究）中，EGFR基因的检测使用了Cobas方法，随着厄洛替尼的获批上市，Cobas被FDA批准作为厄洛替尼的伴随诊断。在阿法替尼及吉非替尼的相关临床研究中，使用了基于ARMS方法的Therascreen EGFR检测试剂盒，FDA在2013年批准了THERASCREEN用于EGFR基因变异的检测。在奥希替尼的临床研究中，采用了Cobas作为EGFR T790M突变的检测手段。这些检测方法目前已经成为临床常用的分子诊断工具，它们之间是否存在敏感性及特异性的差异？有研究报道，在150个NSCLC患者的石蜡切片样本中，分别采用Cobas方法和Therascreen方法进行EGFR基因检测，结果发现两种检测方法的一致性高达98%。

除敏感性和特异性之外，检测方法比较重要的参数是对基因的覆盖程度及流转时间。对基因足够完整的覆盖可使患者不会错过从罕见敏感变异中获益的机会，比较短的流转时间能使患者及时接受治疗。目前可用的商业化试剂盒如Cobas、Therascreen、superARMS，均在L858R、19外显子缺失及T790M突变之外，包括了比较常见的少见突变如S768I、L861Q、G719X，但是这些检测并没有包括其他更罕见的可能对EGFR TKIS敏感的位点。目前暂未查询到ddPCR及BEAMing检测EGFR罕见突变的报道。NGS方法可实现对EGFR基因的完整覆盖，从而不会遗漏罕见位点，同时NGS方法的优势在于可在EGFR基因之外实现多基因的平行检测。但是NGS技术需要相对较长（临床可接受）的流转时间。

NGS、ddPCR、BEAMing的另外一个优势是能够提供EGFR突变在样本中的丰度，此信息可带来更多的临床应用价值。ASTRIS是一项奥希替尼治疗T790M突变患者的真实世界研究（NCT02474355），研究者对患者基线血液进行了ddPCR检测，发现EGFR敏感突变的丰度（大于2.6%或小于2.6%）及T790M突变丰度同敏感突变丰度的比值（大于0.22或小于0.22）与治疗疗效相关；基线敏感突变较高的丰度及T790M丰度同敏感突变丰度较低的比值意味着更差的奥希替尼治疗疗效。

EGFR基因检测首选石蜡切片标本。当肿瘤组织难以获取时利用存在于血液或者其他体液（脑脊液、尿液等）中的游离DNA（cfDNA）进行基因检测，即所谓的液体活检已成为基因分型中不可或缺的替代手段。

cfDNA由凋亡或坏死的细胞释放，主要由种系（白细胞）DNA组成。在癌症患者，cfDNA的一部分可能来源于肿瘤细胞，称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。可以通过适当的方法检测到其中的基因变异，从而减少对侵入性活检的需求。肿瘤组织DNA和血浆ctDNA的基因检测存在一些差异，各有优缺点。首先，肿瘤组织的基因检测，病理科医生会先确认组织样本中有足够数量的肿瘤细胞；而血浆中ctDNA水平通常很低，一般只占cfDNA的0.01%～1%，在某些患者甚至检测不到，因此需要更高灵敏度的检测技术，也存在一定比率的假阴性率。其次，组织样本的基因分析只提供单个部位的基因信息；而ctDNA是来源于肿瘤细胞的游离DNA片段，具有均质性，可洞察跨多个肿瘤部位的分子信息，在肿瘤异质性的情况下具有价值，比如治疗耐药的患者。第三，液态活检相对无创，可多次采样，从而及时有效捕捉治疗过程中的基因变化情况，实现对治疗反应的动态监测。

ENSURE研究中，517名NSCLC患者同时进行了组织及血浆的EGFR基因检测，采用Cobas检测方法，结果显示血浆检测相对组织检测的敏感性为76.7%，特异性为98.2%。基于这个证据，FDA批准了Cobas方法用于血液中EGFR敏感突变的检测。目前Cobas方法是唯一被FDA批准用于EGFR液体活检的检测方法。在其他研究中同样观察到，ctDNA的EGFR突变检测与组织检测相比度特异性高，但敏感性相对较低。IPASS、IFUM和IGNITE研究中血检的特异性分别为100%、99.8%和97.2%，敏感性分别为43.1%、65.7%和49.6%。血检敏感性相对较低可能与肿瘤分期、血液标本的处理、检测方法等相关。因此，如果患者血浆EGFR基因检测结果为阴性，需进行组织样本的补充检测。原国家食品药品监督管理总局在2015年2月批准了吉非替尼说明书更新，增加了一条细则“如果肿瘤标本不可评估，可使用从血液（血浆）标本中获得的ctDNA进行评估”。

获得FDA批准意味着Cobas用于血检有更好的临床证据，但并不意味着Cobas具有最好的检测性能。ddPCR（包括基于ddPCR设计使用了磁珠技术的BRAMing）及superARMS（基于ARMS技术进行了改良）均是针对血液标本设计的检测方法，具有更低的检测下限，更高的敏感性。NGS的优势在于可平行进行多基因检测，其检测下限理论上取决于测序深度。对于单点基因突变的血液检测效能，已经有一些研究对多平台进行了比较。在针对EGFR敏感突变的检测上，以上方法均有证据支持可在保持高特异性的前提下，比Cobas方法有更高的敏感性。BENEFIT研究是一项基于ddPCR血检筛选EGFR敏感突变患者的前瞻性Ⅱ期临床试验，入组患者一线接受吉非替尼治疗，ORR达72.1%，中位PFS为9.5个月，结果证实基于血浆的EGFR敏感突变检测可指导EGFR TKIS治疗。值得一提的是，本研究同时使用了NGS方法进行探索性研究，179名患者同时进行了ddPCR及NGS检测，相对ddPCR，NGS检测的敏感性为100%，证明ddPCR及NGS检测在血浆EGFR基因检测上具有相似的敏感性及很好的临床应用价值。

相比EGFR敏感突变，血液中T790M突变的检测更加困难，对其检测结果的解读相对比较复杂。2015年 Lung Cancer发表了一项研究，比较Cobas、Therascreen、ddPCR及BEAMing四种方法在EGFR突变检测上的敏感性与特异性；相比组织样本，四种方法对EGFR敏感突变的检测敏感性均在80%以上；但是，对T790M突变的检测敏感性上，Cobas仅为41%，相比之下ddPCR及BEAMing的敏感性更高，均为71%。从特异性上看，相比组织，Cobas及Therascreen对T790M的检测均为100%，而ddPCR及BEAMing为83%及67%。这种现象也见于其他的研究。Adelos是一项前瞻性使用四种平台（Cobas、super-ARMS、NGS及3D数字PCR）检测EGFR T790M突变入组接受奥希替尼治疗的临床研究（NCT02997501），2017年在世界肺癌大会上发表了四种平台对T790M突变的检测结果，可以看到，相比组织样本，Cobas、Super-ARMS、NGS及3D数字PCR对T790M突变检测的敏感性分别为57%、61%、71%及69%，特异性分别为88%、71%、67%及46%；NGS检测相比其他方法有最高的敏感性（71%），相对较好的特异性（67%）。这些研究显示，相比Cobas方法，ddPCR、BEAMing及NGS在血浆T790M突变的检测上有较高的敏感性，但特异性相对较低。

AURA系列研究采用奥西替尼治疗T790M阳性的晚期NSCLC，同时对T790M突变的血检平台及其效能进行评估。2017年Jenkins等报道AURA及AURA2研究的Pool分析结果，T790M突变的血检（采用Cobas方法）相比组织检测，其敏感性和特异性分别为61%及79%，把Cobas方法与NGS方法的血检结果相比较，两者阳性与阴性一致率均≥90%。从客观缓解率上看，组织T790M检出阳性，患者的ORR为62%～70%；Cobas血检T790M阳性，患者ORR为59%～70%，两者疗效相似；但是，有趣的是，Cobas血检T790M阴性患者，ORR也达到了68%～70%，提示血检T790M存在较高的假阴性率。2018年Oxnard等报道AURAⅠ期研究中血浆基因分型与奥西替尼疗效的相关性分析，该研究采用BEAMing方法血检T790M突变，采用Cobas方法检测组织T790M突变。结果发现T790M突变血检的敏感性为70%，58例组织T790M检测阴性的患者中，18例患者（31%）血检阳性。血浆与组织检测T790M阳性的患者，奥西替尼治疗的ORR及中位PFS基本一致（ORR 63%vs 62%，mPFS 9.7 vs 9.7个月），提示血检T790M阳性可以预测奥西替尼的疗效，从而让一部分患者避免组织活检。研究还发现，血浆T790M阴性患者的中位PFS达8.2个月，ORR 46%，对这部分患者进一步分析，发现其中组织T790M阳性患者可以从奥西替尼治疗中获益，ORR 69%，PFS 16，5个月；而组织T790M阴性患者ORR仅25%，PFS 2.8个月；进一步证明用BEAMing方法血检T790M同样存在较高假阴性率，需要对这部分患者进一步采用组织样本进行T790M检测。总之，血浆检测EGFR 790M突变的敏感性约在50%～70%，特异性约70%～80%，体现了EGFR耐药突变本质上是亚克隆基因组事件，并且存在异质性。

从现有证据看，血检阳性患者可从EGFR TKIs治疗中获益。对于敏感突变，血检的灵敏性及特异性均较好，是组织活检很好的补充和替代。对于T790M突变，可以在组织活检前先进行血检筛选，如果血检阳性，直接予第三代EGFR TKI治疗；对于血检阴性患者，需要进一步进行组织T790M检测。至于不同的血检方法是否存在差异，目前很难全面回答，因为很少有研究在接受第三代EGFR TKI治疗的同时，预留多个配对的组织和血浆标本进行严格地比较分析。初步结果显示，数字PCR比Cobas的敏感性稍高；能够定量的检测方法比半定量的更有吸引力，因为它可以监测血浆中的突变负荷，及时洞察治疗疗效。血浆NGS有潜力检测广泛的耐药机制，提供全面的基因组信息。

除血浆之外，有研究显示胸水、肺泡灌洗液、尿液以及脑脊液均可作为EGFR基因检测的样本。其中研究最多的是胸水。2019年的一项荟萃分析回顾了既往同时有组织及胸水样本进行EGFR检测的研究。胸水（包括细胞蜡块及上清液）检测EGFR的敏感性和特异性分别为86%及93%。不同方法（包括ARMS及测序法）的敏感性为78%～93%，特异性为90%～100%，证实胸水EGFR检测是组织样本检测的一个替代方法。另外有研究探索了肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage）及支气管刷洗液（Bronchial washing）中EGFR的检测情况，12名组织EGFR检测阳性的患者中，9名患者在肺泡灌洗液中检出了EGFR变异，而支气管刷洗液中仅两名患者检出。三代EGFR TKI药物Rociletinib的临床试验（TIGER-X）中，使用BEAMing方法对治疗前的组织、血液及尿液进行了T790M的检测，血液及尿液相对组织的检测敏感性分别为81%及82%，并且组织、血液及尿液中检出EGFR T790M阳性患者接受Rociletinib治疗疗效相当。

EGFR突变阳性患者脑膜转移发生率较高，由于血脑屏障的存在，血液样本并不能很好反映脑部病灶的基因变异情况。有研究显示，对EGFR阳性且发生脑膜转移的患者，使用NGS方法对配对的原发灶、血液及脑脊液样本进行基因检测，可发现脑脊液样本与原发灶的基因信息高度一致。

EGFR突变可能合并其他基因变异，下游或旁路信号通路激活可能引起EGFR TKIS治疗的原发或继发耐药。临床证据表明，基线EGFR突变合并其他驱动基因变异及抑癌基因变异、细胞周期信号通路基因变异均可能降低EGFR TKIS的治疗效果。但是目前暂无临床证据可针对此类患者采取临床措施，如密集监控或更换治疗手段。

对于EGFR TKIS耐药后患者，可从靶向旁路驱动基因的药物中获益。其中出现频率较高的旁路基因变异包括MET扩增、HER2扩增、BRAF V600E突变及基因融合（如ALK、RET）等。临床证据最为明确的是耐药后出现MET扩增患者可从MET抑制剂中获益。2019年ASCO会议上报道了一个双靶点新药JNJ-372，同时靶向EGFR和cMET基因，Ⅰ期临床研究显示在EGFR TKI耐药人群观察到不错的疗效。随着奥西替尼一线治疗人群的增多，覆盖旁路信号通路的多基因平行检测显得尤为重要。

液态活检技术的快速发展为EGFR基因动态监测及耐药研究打开了大门。早期FASTACT-Ⅱ研究表明，在EGFR TKI治疗期间血液中持续检测到EGFR突变与较短的无进展生存期和总生存期相关。BENEFIT研究通过对ctDNA动态监测同样发现，在接受吉非替尼治疗后第8周，血液ctDNA中出现EGFR清除与较长的无进展生存期显著相关。如何利用ctDNA动态监测来改善患者的总生存。首先检测方法的高灵敏度和高特异性对有效监测至关重要；第二，需要适当和有效的干预措施，动态监测才有意义；第三，需要前瞻性的研究来验证动态监测的作用，确定最佳的干预时间点。目前一项前瞻性的Ⅲ随机对照研究正在进行中，拟通过动态监测血T790M突变，确定奥西替尼的最佳用药时间。

SCLC转化约占EGFR TKIs耐药机制的10%。大多数SCLC转化的耐药患者预后很差。一些研究报告显示TP53突变和RB1缺失在SCLC转化过程中普遍存在，而且这些分子改变发生在治疗过程的早期，甚至在治疗干预前。更好地了解SCLC转化的分子基础，有助于确定早期干预的策略。

TKIs耐药机制的深化研究奥西替尼治疗T790M阳性患者的mPFS约在10个月左右。c797s突变是其主要耐药机制之一，但仅占10%～20%；T790M缺失约占耐药患者的30%～49%，其中不少患者出现旁路激活及小细胞转化。目前尚无针对三代TKI耐药的有效靶向药物，而且这些患者经常面临组织标本不可获取的局面。如何利用液态样本综合分析耐药机制，找到应对策略，是改善患者预后的重要手段。

分子基因检测是治疗晚期NSCLC患者的首要策略。晚期非鳞NSCLC患者应常规进行基因检测；鳞癌患者，可在不吸烟、小样本及混合腺癌成分的患者中进行基因检测。可依据血检阳性结果使用EGFR TKIS药物，但血检阴性患者需要组织检测作为补充。其他液态标本，如胸水、肺泡灌洗液、脑脊液及尿液可进行EGFR基因检测，仍需要更多临床证据进一步验证。不同的检测方法对基因的覆盖范围、灵敏度、流转时间以及价格会有不同，应权衡各种因素进行选择。NGS可以用一个样本进行多基因平行检测，更能满足日益增长的临床需求。

NSCLC分子诊断面临着诸多挑战，解决这些问题除了需要对肿瘤生物学有更深入了解外，还需要技术上的改进。同时需要加强临床管理、样本处理、信息技术基础设施建设以及病理医生和相关临床医生的专业发展。伴随着这些巨大挑战，有机会改善基因检测的精确性、及时性、实用性以及随之而来的患者预后。