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第六节 眼部病毒感染的检测
眼部冠状病毒检测与诊断手段众多,包括细胞学检查、免疫学检查、分子生物学检查等。
一、细胞学检查
涂片细胞学检查是一种有创的检测方式。在裂隙灯生物显微镜下刮取眼部组织(角膜或结膜的组织细胞),继而通过涂片及染色方法,在光镜下对细胞内病毒包涵体、合体细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等进行观察,有助于对冠状病毒感染的诊断。此外也可涂片后直接进行电镜检测。
以眼表组织为例,其大致的取材步骤包括:
(1)表面麻醉:
1%丙美卡因滴眼液1~2滴,进行表面麻醉。
(2)取材:
在裂隙灯生物显微镜或手术显微镜下用15号圆形手术刀片刮取病变边缘或组织表面(如角膜溃疡、结膜滤泡、乳头、结膜伪膜等)。
(3)涂片:
取材完成后,将组织均匀涂布于洁净载玻片上,尽可能形成单层或薄层细胞。
二、免疫学检查
免疫学检查的核心原理,是检测冠状病毒的抗原或抗体,也可检测病毒的代谢产物。依其原理可主要分为三种:免疫荧光法、免疫化学法、血清学检查。
1. 免疫荧光法为病毒辅助诊断的主要方法之一,此种方法主要的优势在于分离培养非急性期病毒。
2. 免疫化学法的原理是利用特异性酶标记病毒的抗原或抗体,无需荧光染料,因此也称为酶联免疫法。
3. 血清学检测包括:中和试验、补体结合试验、血清抑制实验、乳胶凝集试验、化学发光测定等。此种方法可在一定程度辅助判断冠状病毒感染的可能性,但有一定局限性。
三、分子生物学检查
分子生物学检查是以聚合酶链反应(PCR)为核心原理的检测方法。其方法相对灵敏,对于提高冠状病毒检出率,明确病因有重要作用。此外,也可对病毒拷贝数进行半定量或定量检测,用于病原体的快速诊断。
由于眼部标本的样本量小,采集时应尽可能地多采集一些标本(眼表及眼内标本均需要),且应在发病早期或急性期采集标本,从而提高检出率(因拷贝数较高)。在进行眼表组织病毒检测标本的采集时,可同时采集泪液,提高潜在的病毒核酸含量。标本应采用冷链转运,在2~8℃下短期保存,-80℃下长期保存。
较为常用的PCR方法包括:RT-PCR、实时定量PCR、多重PCR等。
RT-PCR主要用于检测RNA病毒,基本原理与普通PCR类似。此种方法需要在第一轮循环时进行逆转录cDNA的合成。实时定量PCR分为染料法或探针法,例如SYBR Green或TaqMan探针。实时定量PCR的主要优势在于可监测扩增进度,并通过标准曲线判断初始的拷贝数。多重PCR是多重病毒感染、病毒及其他病原体混合感染时的主要检测方法。通过合理有效的多对引物设计,采用多重PCR可以提高混合感染的实验室诊断效率。
(编者:姚沁楠 接英 王开杰 王丹丹 李玉 范蕊 马小杰)
(审校:李婧 张阳)