不同健康状况的脐橙土壤与黄龙病的关系
北京理工大学化学与化工学院，北京100081
摘要：通过基础氮、磷含量测量以及土壤内微生物分梯度涂布、观察、计数，分析抑制黄龙病发生的方法。结果显示，控制土壤磷酸根含量，使其达到2mg/L以上水平是可深入研究的方法，黄龙病染病株土壤中真菌含量与柑橘内生菌有一定联系。
关键词：土壤 黄龙病 微生物
1 背景与目的
柑橘黄龙病，又称为柑橘黄梢病，各龄柑橘树均易感染，感染柑橘树常表现为树叶黄化、结果少、果实酸涩等现象。国内外目前在柑橘黄龙病防治方面采取的办法主要集中于种植无病毒苗、搞好种植防护网等，关于通过控制土壤环境抑制黄龙病的方法还有待探索。在柑橘土壤微生物方面已发现17种典型的柑橘黄龙病伴生真菌属和10种伴减真菌属，而在柑橘土壤肥料控制方面，则文献较少。
2017年7月中旬，北京理工大学15名学生及3名指导老师奔赴江西多地对柑橘树黄龙病研究进行走访调查。
将在瑞金、寻乌、安远等多地采集的柑橘土壤样本，进行不同浓度梯度的微生物涂布，对比不同样本材料间微生物种类、数量的差异，并结合土壤pH、COD、氮、磷等指标，找出黄龙病染病与土壤条件之间的关系，达到通过土壤条件抑制黄龙病的目的。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 土壤材料
本实验所用植物材料信息见表1。
表1 植物材料采集信息
注：材料保存方法是用信封或密封袋保存。
2.1.2 试剂
土豆、葡萄糖、琼脂、全氮试剂（WAK-TN.i）、磷酸试剂（WAK-PO4）、钾试剂（五马钾离子检测试剂）、COD试剂（WAK-COD,0-100mg/L）、pH测试仪。
2.1.3 工具
三角瓶、酒精灯、剪刀、镊子、空培养皿、接种环、移液枪、计时器、空烧杯、灭菌锅、恒温培养箱。
2.2 实验方法
2.2.1 土壤采集
取土壤表面以下10cm处柑橘毛细根部土100cm2，每棵树至少采集2个样本，使用信封或密封袋保存。
2.2.2 基础参数检测
基础参数试验在样本采集当天完成。表2为基本参数测试信息。
表2 基本参数测试信息
2.2.3 土壤微生物分离培养
2.2.3.1 配制培养基
2017年7月19日，配制PDA固体培养基，方法如下：
土豆400g，切丁后煮30min，过滤后取滤液，加葡萄糖40g，琼脂30g，水定容到2L。分装至500mL三角瓶中，装液量300mL，高压灭菌锅121℃灭菌20min。
2.2.3.2 土壤稀释后涂布
2017年7月19日，将土壤材料混合均匀，并在超净工作台上用无菌滤纸各称取1g，溶于10mL无菌水中，并做梯度稀释处理。30min后吸取200μL液体涂布于PDA固体培养基。最后用封口膜封住培养皿边缘，并拿灭菌报纸包裹，放在室温（27℃）下培养，两天后观察菌落生长结果，记录菌落形态及种类信息。
无菌水灭菌方法：将100mL无菌水加入250mL三角瓶中，加棉塞包扎，放入101℃高压灭菌锅中灭菌20min。
涂布平板数见表3。
表3 7月21日土壤材料涂布平板数
续表
3 结果与分析
3.1 全氮、磷酸、钾离子、COD、pH测定结果
基本参数数据如表4所示。
表4 基本参数数据
注：由于此类实验为当地测试，而5号、6号实验样本土壤量采集较多，故分为两袋放置，各分两组进行测定，微生物实验时均将两袋混合视为一个样本进行实验操作。
由表4可以看出：
3.1.1 全氮含量
安远县抗性株及抗性株嫁接1代的全氮值均在1mg/L左右，而其余地区的健康株或染病株的全氮值均在0.2～0.5mg/L，抗性株土壤的此项数据要远高于其他柑橘树土壤，然而安远县所采的健康株土壤样本全氮值也有此特征。根据近30年江西省各地全氮含量显示，江西地区全氮含量基本维持在1.0mg/L左右，部分地区在0.5mg/L左右，极少数地区在2.0mg/L以上，且2.0mg/L以上地区基本集中在南昌市附近。因此，此项数据可作为抗性株及健康株的一个参考，然而其影响并不会很大，极有可能是地区土壤差异引起的。
3.1.2 磷酸含量
健康株及抗性株、抗性株嫁接1代的磷酸含量基本都在2mg/L及以上，除了石门村健康株中有一株土壤在0.5mg/L，处于较低水平。寻乌县的两株染病株磷酸含量一株为1mg/L、一株为0.2mg/L，都处于较低水平。因此，控制土壤磷酸含量，如果农施柑橘肥料时适当提高磷酸肥的比例可以在一定程度上预防柑橘黄龙病的发生。
3.1.3 钾含量
江西省南部各地柑橘健康株土壤钾含量都在375～625mL，而安远县抗性株两个样本的三组数据在375～425mL，寻乌县两个染病株土壤钾含量则也是在375～450mL，虽然抗性株以及染病株钾含量都相对偏低，然而健康株中也有部分数据处于这个范围，因此并不能将钾含量偏低作为参考标准之一。
3.1.4 COD含量
健康株柑橘毛细土壤共五个样本的六组数据都在13～100mL内；抗性株的三组数据则在5～20mL，数据处于较低区间；而染病株的两组数据也在13～20mL这一范围间，相对偏低。九组样本共十一组数据中50mL以下的占七成，因此COD含量偏低也不能作为参考标准之一。
3.1.5 pH值
柑橘土壤的pH值共十一组数据均在5.50～7.18mg/L这个范围内，除安远县抗性株即样本5号的第二组数据显示土壤略偏酸性以外，其余样本数据均显示土壤为弱碱性环境，抗性株土壤pH值以及染病株土壤pH值与健康株相比并无明显差别，而pH值对土壤吸持磷酸根的影响规律很难一概而论，因此pH值也不能作为抑制黄龙病的土壤参考标准之一。
3.2 微生物菌落数量与多样性结果
从7月19日涂板起，至7月21日观察到株菌，株菌形态描述如表5所示。
表5 7月19日涂板至7月21日观察微生物形态描述来源（2天，室温，PDA/牛肉膏）
续表
续表
从表5可以看出：
3.2.1 土壤真菌种类比
黄龙病染病株柑橘毛细土壤中的真菌种类比在0.25～0.30，而健康株除样本2号外，真菌种类比则在0.00～0.25，略小于染病株，然而染病株真菌数量在103～104个，而健康株则基本保持在104～105个，大于染病株。研究指出，柑橘黄龙病株根际土壤真菌群落平均Chao指数比健康株的高21.4%，平均Ace指数比健康株的高29.2%，所得数据验证此结论。
3.2.2 柑橘内生菌与土壤真菌关系
研究表明，柑橘健康株的内生细菌的种类与数量比患病株的内生细菌数量少，而表5中显示的土壤中微生物含量，健康株内生菌种类在4～5种，而患病株则在4～7种，要略多于健康株，因此有关黄龙病与柑橘内生细菌以及土壤中微生物的相关联系还需进一步调查证明。
4 结论与展望
研究得到全氮含量、磷酸根含量、钾离子含量、COD、pH数据11组，其中磷酸根浓度高于2mg/L有利于抑制柑橘黄龙病的发生，其他指标无明显趋势现象。涂板60组，得到不同土壤的菌落数量41组。
土壤磷酸根含量对抑制黄龙病发生有明显差异，其中将土壤中的磷酸根含量控制在2mg/L以上有利于抑制柑橘黄龙病的发生。柑橘毛细土壤微生物与柑橘内生菌之间存在联系，其中土壤中的真菌菌落数分布趋势与生长状态和柑橘内生菌中的真菌生长有正向联系。
5 参考文献
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