2.1.4 溶栓酶的测定方法

目前常用的溶栓酶的活性测定，主要包括有纤维蛋白平板法及以下几种方法。

2.1.4.1 纤维蛋白平板法

国外在1952年建立了纤维蛋白平板法来测定溶栓酶的活性。用缓冲液配制5U/mL的凝血酶溶液，20mg/mL的纤维蛋白原溶液，3%的琼脂。首先将琼脂加热融化，然后将其冷却到45～50℃，加入纤维蛋白原溶液，将二者混合混匀，然后再向内加入凝血酶溶液，将其迅速混和均匀后，立即倒平板。在平板凝固以后，用打孔器打孔，然后将10μL的待测样品和不同浓度的尿激酶标准品，加入到打好的小孔中，在37℃培养24h后，测量溶解圈的直径。再以尿激酶的浓度为横坐标，以溶解圈直径的乘积为纵坐标，绘制标准曲线。这种方法相对测定结果较准确，而且操作方便，具有很好的可重复性，是目前普遍使用的溶栓酶的测定方法。

2.1.4.2 反应时间法

用pH值为7.8的巴比妥—氯化钠缓冲液来配制浓度为6.67mg/mL牛纤维蛋白原溶液和6U/mL的牛凝血酶溶液，用pH值为9.0的Tris-HCI缓冲液来配制浓度为1.4U/mL的牛纤维蛋白溶酶原溶液，分别放置，在使用时，将牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液按照等体积进行混匀。然后将尿激酶标准品，用巴比妥—氯化钠缓冲液配成浓度为60U/mL的标准尿激酶溶液。取试管4支，分别加入牛纤维蛋白原溶液0.3mL，分别加入不同体积的溶液，溶液体积分别为0.9mL、0.8mL、0.7mL和0.6mL的巴比妥—氯化钠缓冲液，然后在试管中再依次分别加入不同体积的尿激酶标准品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL和0.4mL，然后摇匀，放在37℃水浴中，当发现形成凝块，其中凝块内的小气泡上升到反应系统的体积一半时，反应达到终点。然后以尿激酶的浓度为横坐标，以反应到达终点的时间与入水浴时间的差值为纵坐标进行绘图，制作标准曲线。在标准曲线上求出溶栓酶的活性。但这种方法存在误差较大，时间不易控制，操作较困难，重现性较差。

2.1.4.3 TAME底物法

2006年，根据溶栓酶对精氨酸羧端的肽链有较强的切割作用，熊迎新等设计了以对甲基苯黄酰-L-精氨酸甲酯（TAME）为底物来测定溶栓酶活性的方法。在37℃条件下，溶栓酶能将底物切割成甲醇和对甲基苯磺酰-L-精氨酸，然后高锰酸钾能将甲醇氧化成为甲醛，甲醛再与酸发生显色反应。产生的这种蓝紫色复合物非常稳定，这种复合物的最大吸收峰为574nm，实验检测溶栓酶灵敏度非常高。实验在此基础上，还建立了这种方法与纤维蛋白平板法之间的对应关系。这种方法的灵敏度高，操作相对很简便，但这种方法必须与纤维蛋白平板法结合来使用，才能进行测定。

2.1.4.4 酶标仪法

这种方法是在纤维蛋白平板法上的改进方法，采用96孔板，在这些小孔内，按照纤维蛋白平板的制作方法来制备纤维蛋白平板，然后在不同的小孔中加入不同浓度的标准尿激酶溶液。测定方法的基本原理是由于纤维蛋白在630nm时的吸光值最大，随着它的溶解，吸光值会逐渐下降，下降值与尿激酶的浓度呈正比。然后37℃培养，在培养过程中，每隔30min，在630nm下采用酶标仪测定一次吸光值，计算不同时间点测定的吸光值与初始吸光值的差值，再按照最小二乘法的方法求出斜率，根据公式来计算溶栓酶的酶活力。酶标仪法可在短时间内同时测定多个样品，因此具有样品消耗小，成本低的特点，但这种测定方法需使用酶标仪，在一定程度上限制了这种方法的应用。

2.1.4.5 四肽底物法

人们研究发现溶栓酶对底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）非常敏感，因此可以按照测定枯草芽孢杆菌蛋白酶E的方法来测定溶栓酶的酶活力。首先配制一定浓度的四肽底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）溶液，在其中加入溶栓酶样品，在37℃培养1min后，采用分光光度计在410nm处测定单位时间内吸光值的变化。按照这种方法，1min内酶水解四肽底物生成1μL的硝基苯胺的溶栓酶的量被定义为1U。四肽底物法相对较简便、测定时间较短，但底物的活性与溶解纤维蛋白的活性之间的相关性还需要进行深入的研究。

2.1.4.6 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是将溶栓酶与溶栓酶的单克隆抗体相结合，再将其与带有标志酶的多克隆抗体相结合，然后通过标志酶与过氧化物酶之间的反应来测定溶栓酶的活力。这种测定方法的灵敏度非常高，可以达到0.1ng/mL，而且实验的交叉反应小，但是这种方法的测定成本高，相对而言实验操作复杂，有待进一步进行研究以降低生产成本。