第二章 库尔勒香梨抗冻力与抗冻生理生化特性研究

第一节 库尔勒香梨枝条、花芽冻害发生程度与相关生理生化指标关系的研究

2011年，库尔勒地区出现持续降雪和大幅度降温的恶劣天气，使库尔勒地区的梨树遭受不同程度的冻害。为此，我们对休眠期间库尔勒香梨受不同程度冻害的一年生枝条、花芽的可溶性糖、游离脯氨酸、POD活性、MDA含量，以及N、P、K、Ca、Mg含量进行分析，对库尔勒香梨发生不同程度的冻害时的相关生理指标、营养元素与抗冻性的关系进行探讨，以期为库尔勒香梨树体的抗冻性鉴定、抗冻栽培和抗冻生理研究提供初步的科学依据。

一、试验

（一）试验材料

试验材料取自库尔勒市。笔者对全市库尔勒香梨园进行了冻害调查，划分了枝条的三种冻害程度和花芽的两种冻害程度，其标准如下：

（1）枝条轻度冻害：枝条表面出现少量黑色斑点，髓部变色。

（2）枝条中度冻害：韧皮部、木质部呈半死状态，木质部变色。

（3）枝条重度冻害：韧皮部、木质部呈全死状态，韧皮部变色。

（4）花芽中度冻害：花芽心部发黑，发芽迟，萌发后花器不完全或呈畸形。

（5）花芽重度冻害：花芽整体发黑，易从基部取下，不萌发，僵芽脱落，即将开放花芽受冻后柱头呈枯黑状或雌蕊变成褐色

按以上标准取树势一致的外围一年生枝条及花芽，以正常枝条与花芽为对照（根据对取样树其后整个生长季的跟踪观测，证明了取样的科学性）。

（二）试验方法

1．可溶性糖含量的测定

可溶性糖的含量可采用蒽酮法进行测定。称取剪碎均匀的枝条韧皮部0.1g，加入10mL蒸馏水，塑料膜封口，放入恒温沸水浴中煮沸提取2次，每次30min。取出后将提取液冷却至室温，再将提取液过滤到25mL的容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

吸取上述提取液0.5mL于试管中，加1.5mL蒸馏水、0.5mL蒽酮试剂和5mL浓硫酸，以空白作为对照，将各管充分摇匀，于沸水浴中保温1min，取出后冷却至室温。然后在630nm波长下比色，以空白对照调零，记录吸光度值。根据可溶性糖的标准曲线，查出测定液的可溶性糖含量。计算公式如下：

可溶性糖含量（%）=（C×V1×n）/（W×V2×106）×100%

式中：

C——标准曲线求得的糖含量（单位：μg）；

V1——提取液总体积（单位：mL）；

V2——测定时所吸取的体积（单位：mL）；

n——稀释倍数；

W——样品质量（单位：g）。

2．游离脯氨酸含量的测定

游离脯氨酸的含量可采用酸性茚三酮染色法进行测定。称取韧皮部0.5g，放入研钵中，加入80%乙醇3mL研成匀浆，将匀浆移入试管中，并用80%乙醇冲洗研钵，匀浆与洗液合并总量为10mL，加盖后用沸水浴加热10min，然后加入0.25g活性炭粉末，振荡、过滤，并用80%乙醇洗试管、滤渣和滤纸3次以上，直至残渣中无游离脯氨酸为止。将滤液收集在烧杯中，置于80℃～85℃水浴中蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL。取上述提取液10mL加入大试管中，再加入人造沸石1g，摇动10min，滤去人造沸石。取2mL滤液加入试管中，再加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，摇匀并盖上试管胶塞，在100℃水浴中加热20min，冷却后，用分光光度计在515nm波长下测定光密度，从标准曲线中查出脯氨酸含量。计算公式如下：

脯氨酸含量（μg/g）=（C×V/a）/W

式中：

C——提取液中脯氨酸含量（单位：g），由标准曲线求得；

V——提取液总体积（单位：mL）；

a——测定时所吸取的体积（单位：mL）；

W——样品质量（单位：g）。

3．丙二醛（MDA）含量的测定

库尔勒香梨枝条中的丙二醛（MDA）含量可采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法进行测定。称取韧皮部0.2g，剪碎，加入1mL 10%的三氯乙酸（TCA）研磨至均浆，再加入4mL 10%三氯乙酸一同倒入离心管，把离心机的转数调节为4000 r/min，将匀浆离心10min，吸取上清液2mL，加入2mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA），摇匀。摇匀后，将试管放入电热恒温水浴箱中，在沸水浴中加热10min，取出试管冷却后，在转数为3000 r/min的离心机中离心15min。吸取上清液在721型分光光度仪上，分别测定在波长450nm、532nm、600nm下的光密度值（用2mL TBA+2mL水做对照比色），并计算丙二醛的含量。计算公式如下：

式①②中：

C——提取液中丙二醛的浓度（单位：μm o l/L）；

V——提取液的总体积（单位：mL）；

V1——样品提取液和TBA溶液总体积（单位：mL）；

V2——与TBA反应后的样品提取液体积（单位：mL）；

W——样品鲜重（单位：g）。

4．过氧化物酶（POD）活性的测定

过氧化物酶（POD）活性可用愈创木酚氧化法进行测定。在过氧化物酶的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。该茶褐色产物在470nm处的吸光值最大，故可通过测试470nm下吸光值的变化测定过氧化物酶的活性。实验步骤：称取0.2g叶片洗净后置于预冷的研钵中，分两次加入1.6mL（分别为0.8mL、0.8mL）预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.8），在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中，在4℃、12000g下离心15min，上清液即为POD粗提液。取100mL磷酸盐缓冲液（PBS, pH=6.0）置于烧杯中，并加入0.037mL愈创木酚（2-甲氧基酚），置于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入0.056mL 30%的H2O2，混合均匀备用。取3mL反应液并加入40 μl酶液，以PBS代替酶液为对照调零，在470nm波长下进行比色，测定光密度/吸光值（optical density, OD）在40 s内的变化（由于该反应迅速，加入酶液后要立即进行吸光值的测定）。以每分钟OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（U），按以下公式计算活性：

POD活性（u/g·min）=（△A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）

式中：

△A470——反应时间内吸光度的变化；

W——样品鲜重（单位：g）；

t——反应时间（单位：min）；

Vt——提取酶液总体积（单位：mL）；

Vs——测定时取用酶液的体积（单位：mL）。

二、结果与分析

（一）库尔勒香梨枝条冻害发生程度与生理指标的关系

1．枝条冻害程度与部分生理指标的关系

由表2-1可知，不同冻害程度枝条的各生理指标均存在显著的差异性。正常枝条的脯氨酸、可溶性糖和MDA含量整体上随着冻害发生的严重而下降。其中，脯氨酸含量下降幅度最大，达到66.4%；可溶性糖含量下降幅度为38.7%; MDA含量先升高，后下降。而POD活性随冻害程度的不断增强而升高，受重度冻害枝条的POD活性最高，比对照品增加了61.7%。

2．枝条生理指标相关性分析

由表2-2可知，脯氨酸含量与可溶性糖含量、MDA含量呈正相关，与POD活性呈负相关，与可溶性糖含量、POD活性呈显著相关，相关系数分别为0.8994、-0.9836。可溶性糖与POD活性呈极负相关。POD活性与MDA含量呈负相关。其中，MDA含量与各指标相关性不高，脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性之间相关性高。

（二）库尔勒香梨枝条发生冻害程度与营养元素含量的关系

1．枝条冻害程度与营养元素含量的关系

由表2-3可知，枝条不同程度冻害发生与各营养元素含量均存在显著的差异性。枝条的N、K、Ca、Mg含量随着冻害发生的严重而下降。其中，Ca、Mg含量下降幅度较大，分别为77.2%和78.7%; N、K含量下降幅度较小，分别为64.8%和74.6%，而P含量没有明显变化。

2．枝条营养元素含量相关性分析

由表2-4可知，各元素含量之间均呈正相关。其中，N与各元素均呈极显著相关，P与K、Ca与Mg呈极显著相关，相关系数分别为0.94、0.93。

（三）库尔勒香梨花芽发生冻害程度与生理指标的关系

1．花芽不同冻害程度与生理指标的关系

由表2-5可知，花芽不同程度冻害发生与各生理指标均存在显著的差异性。正常花芽的脯氨酸和可溶性糖的含量，以及POD活性随着冻害发生的严重而下降。其中，脯氨酸含量下降幅度最大，达到65.2%; POD与可溶性糖含量其次，下降幅度分别为44.9%、39.7%，而MDA含量先下降后升高。

2．花芽生理指标相关性分析

由表2-6可知，脯氨酸含量与可溶性糖含量、POD活性呈极显著正相关，相关系数分别为0.89、0.94；可溶性糖含量与POD活性呈极显著相关，相关系数为0.96;MDA含量与各指标呈负相关，相关性不显著；脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性之间相关性显著。

（四）库尔勒香梨花芽发生冻害程度与营养元素含量的关系

1．花芽不同冻害程度与营养元素含量的关系

由表2-7可知，花芽冻害发生程度与各营养元素含量均存在显著的差异性。正常花芽的N、K、Mg含量随着冻害发生的严重而下降。其中，K含量的下降幅度最大，下降幅度为93.6%; N、Mg含量的下降幅度其次，下降幅度分别为52.9%和67.2%。而P含量没有明显变化，Ca含量逐渐升高，比对照增加了38.7%。

2．花芽营养元素含量相关性分析

由表2-8可知，各元素之间均呈极显著相关性，Ca与各元素呈极显著负相关。其中P与各元素相关性极显著，K与Ca相关性相对不显著，相关系数为-0.72。

三、小结

第一，冻害程度越严重，库尔勒香梨的枝条和花芽的游离脯氨酸含量和可溶性糖含量越低，并且差异性显著；POD活性、MDA含量变化不具有一致性，因此，可将游离脯氨酸含量和可溶性糖含量作为库尔勒香梨树的主要抗寒生理指标。

第二，冻害程度越严重，枝条和花芽的N、K、Mg含量越低，并且差异性显著，而Ca的含量变化不具有一致性，P的含量差异不明显。因此，可将N、K、Mg含量作为库尔勒香梨树的主要抗寒营养元素指标。