第二节　分子生物学诊断实验

对分枝杆菌分子生物学的研究提供了用于诊断和鉴别分枝杆菌的基因靶点，主要有插入序列（如IS6110）、蛋白质编码基因序列（如65kDa热休克蛋白基因hsp65、rpoB基因、recA基因、MTP64基因等）、16S rDNA、16S-23S rRNA基因内部转录间隔区等。这些基因靶点大致可以分为两类，一类是分枝杆菌属菌种共有，既高度保守又有高度多态性的序列，如分枝杆菌属菌种共有的蛋白质编码基因序列、16S rDNA序列、16S-23S rRNA ITS序列，这些序列既含有属特异性位点，又有种特异性位点，可作为分枝杆菌属及各种分枝杆菌菌种鉴定的靶基因。另一类是只有种特异性或群特异性的DNA序列，如插入序列、结核分枝杆菌复合群菌种特异的蛋白质编码基因序列，可用于相应菌群、菌种鉴定。

随着检测试剂质量的提高，标准化实验室和规范化操作程序的建立，以PCR为基础的结核病分子生物学诊断技术的时效性和准确性已在临床上得到认可。

目前商品化的分子生物学检测方法用于临床检测的四个方面：第一，检测标本中是否存在结核分枝杆菌或/和非结核分枝杆菌的核酸；第二，检测标本中存在的结核分枝杆菌是否存在利福平、异烟肼的耐药基因；第三，鉴定标本中的非结核分枝杆菌的菌种；第四，结核分枝杆菌基因分型。每方面检测均存在应用不同分子生物学方法的试剂盒，这些商品化试剂盒各有特点，各有自己严格的操作步骤说明，各试剂盒操作的便捷性、影响因素和准确性等方面略有差异。下面将总述目前在四方面应用的方法学和注意事项。

一、方法学

1.检测结核分枝杆菌核酸

（1）实时荧光定量PCR检测。

（2）半巢式全自动实时荧光定量PCR检测。

（3）环介导等温扩增检测。

（4）RNA恒温扩增检测。

2.检测结核分枝杆菌耐药基因

（1）线性探针耐多药检测。

（2）基因芯片耐多药检测。

（3）实时荧光PCR熔解曲线耐多药检测。

3.菌种鉴定

（1）基因芯片法。

（2）线性探针法。

（3）核酸探针法。

（4）核酸测序法。

4.结核分枝杆菌基因分型

（1）限制性片段长度多态性分析（IS6110-RFLP）。

（2）间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）。

（3）多位点可变数目串联重复序列分析。

二、注意事项

（1）以上方法大部分以PCR实验为基础，实验室应建立核酸检测的内部质量控制和外部质量控制程序，必须严格遵守PCR实验的要求，无菌操作，分区实施，防止污染。

（2）所有方法的第一步均是处理标本、核酸提取，这一步是实验成功与否的关键。

①操作时尽量避免气溶胶的产生与扩散，避免标本间的污染。

②痰标本视黏稠度加入1～2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡，室温放置15～20分钟，使痰液充分液化，无明显固状物且吸出时无拉丝现象。

③胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、尿液等标本首先需要离心浓缩（3000g，20～30分钟）。

④外周血标本首先用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，生理盐水6000r/min离心5分钟，留取沉淀。

⑤组织标本经研磨粉碎后用生理盐水混匀，3000g，20～30分钟离心，沉淀物与痰标本处理步骤相同。

⑥分离培养物，如果是固体培养物，用无菌的接种环收集少量菌量，悬于1ml无DNA酶/RNA酶的生理盐水中；如果是液体培养物，可以直接移取培养物1ml，95℃灭活20分钟，12 000r/min离心5分钟，留取沉淀。

⑦核酸提取可采用手工法提取核酸或自动化核酸提取仪。手工提取法主要有超声波破碎法、高温裂解法、冻融法等，自动化核酸提取仪主要采取磁性颗粒吸附或硅胶膜吸附真空泵抽滤提取方法。

⑧核酸制备的质和量是检测成功与否的关键步骤，一方面提取的核酸丰度不够，另一方面提取物中可能存在PCR反应抑制物，都会造成假阴性。

（3）阳性质控管应在模板加入待测样品和阴性质控管并盖牢管盖后再按阳性程度由低到高的顺序加入，并立即封管。

三、结果判断

（1）理论上，分子生物学方法检测结核分枝杆菌的敏感性高于结核分枝杆菌培养法的敏感性，文献上报道，分子生物学方法检测结核分枝杆菌的敏感性在80%左右，但是实践上，由于临床标本的复杂性，其中存在的抑制药或者标本处理过程中加入的试剂可能成为抑制药，同时对于核酸丰度较低的样本，手工提取核酸不甚理想，都可以造成实验结果假阴性。因此，临床上，需要对实验室结果进行综合判断。

（2）如果痰涂片阳性、PCR结果阳性，可以报告结核分枝杆菌感染。

（3）如果痰涂片和培养均为阴性，PCR 2次结果均为阳性，排除污染，可报告结核分枝杆菌感染。

（4）如果痰涂片和培养均为阳性，2次PCR均为阴性，可能原因：标本中存在PCR抑制药，或此份标本中结核分枝杆菌的检测片断发生突变或丢失，或可能是非结核分枝杆菌。

（5）如果痰涂片阳性，培养和PCR结果均为阴性，考虑是否为棒状杆菌或诺卡菌等其他抗酸菌感染。

（6）如果痰涂片和PCR结果均为阴性，仅培养阳性，应排除培养过程中气溶胶污染的可能。

（7）耐药基因检测对利福平和异烟肼检测的灵敏度约为90%和80%。

（8）标本可能含有不均一耐药菌株，突变探针和相应的野生型探针可能均为阳性，耐药是否具有表型特征取决于研究中的突变和非突变序列比例。

（9）耐药和菌种鉴定过程相对复杂，费用高，建议在标本分枝杆菌核酸检测阳性的基础上开展。