气相色谱法测定睾酮凝胶中肉豆蔻酸异丙酯的含量
颜红1,2，徐伟娜1,2，刘林1,2，杨清华1,2*
（1．山东省药学科学院，山东省化学药物重点实验室，济南 250101；
2．山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，济南 250101）
睾酮凝胶是一种雄性激素，商品名ANDRGEL®，由美国Unimed公司研发，现由ABBOTT PRODS生产，美国FDA于2000年2月28日批准上市[1]，主要用于治疗男性内源性睾酮激素分泌不足或者缺乏的替代治疗。该制剂为无色透明均匀的水醇凝胶剂，均匀涂于两肩、双上臂或腹部，睾酮经透皮吸收后，可使男性性腺功能低下的患者达到并维持血液中正常睾酮浓度[2]。肉豆蔻酸异丙酯（IPM），又名十四酸异丙酯，是一种很重要的长链羧酸酯类化合物[3]，极易被皮肤吸收。是半固体基质的组分之一，也可作为局部给药制剂中许多物质的溶剂，应用于各种局部制剂和化妆品中[4]。作为透皮吸收促渗剂，能显著提高睾酮凝胶的经皮透过速率[1]。
药物制剂中肉豆蔻酸异丙酯的含量测定方法鲜有报道。本文采用气相色谱法，测定了自制睾酮凝胶中肉豆蔻酸异丙酯的含量。该方法专属性强、准确度和重复性好，简便可行。
1 仪器与试药
Agilent 6890N气相色谱仪包括氢焰离子化检测器、HV-5空气压缩机、SPE-300氢气发生器；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯对照品（梯希爱化成工业发展有限公司，批号：AGNO1 ）；棕榈酸异丙酯（梯希爱化成工业发展有限公司，批号：GJ01-BHWJ）；睾酮凝胶（自制，批号为20141201、20141202、20141203）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 5%苯基-95%二甲基硅氧烷的毛细管柱（美国GS-TEK公司，GsBP-5，30m× 320μm×1.8μm），载气为氮气，纯度99.999%，流速2.0ml/min，氢气流速30ml/min，空气流速300ml/min，柱温220℃，检测器温度250℃，进样口温度230℃，分流比为10 : 1，尾吹：25，进样量2μl。
2.2 溶液的制备
（1）对照品溶液的制备 精密称取肉豆蔻酸异丙酯对照品125mg，置25ml量瓶中，以正己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml置10ml量瓶中，以正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
（2）供试品溶液的制备 精密称取睾酮凝胶2.5g（约相当于肉豆蔻酸异丙酯12.5mg），置烧杯中，加正己烷适量，搅拌、超声提取3次，提取液转移至25ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
（3）阴性对照品溶液的制备 按处方工艺制备不含肉豆蔻酸异丙酯的样品，同供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。
2.3 方法学研究
（1）系统适应性试验 精密称取肉豆蔻酸异丙酯45mg和棕榈酸异丙酯5mg，置于同一10ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即为系统适应性溶液。精密称取肉豆蔻酸异丙酯125mg，置于25ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液2μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图（见图1），结果显示系统适应性溶液中，肉豆蔻酸异丙酯峰与棕榈酸异丙酯峰分离良好（分离度R≈18.9）。
图1 系统适应性溶液色谱图
a—肉豆蔻酸异丙酯；b—棕榈酸异丙酯
（2）专属性试验 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各2μl，依法进行测定，结果阴性对照品溶液无干扰。
（3）线性与范围 精密称取肉豆蔻酸异丙酯125.5mg，置25ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀；分别精密量取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml置于10ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液各2µl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以峰面积A对浓度c进行线性回归，得回归方程：A=2186.1c +13.673；r=1，表明肉豆蔻酸异丙酯在0.1004～2.51mg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系。
（4）精密度试验 精密称取肉豆蔻酸异丙酯适量，加正己烷溶解并稀释制成0.7mg/ml的溶液，重复进样6次，每次2µl，记录色谱峰图及峰面积，结果肉豆蔻酸异丙酯峰面积的RSD为1.61%（n=6）。
（5）溶液稳定性试验 取“2.2”项下的供试品溶液及对照品溶液，分别于0、2h、4h、6h、8h进样，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积。结果表明对照品溶液的RSD为1.76%，供试品溶液的RSD 1.16%，表明对照品溶液和供试品溶液在8h内稳定。
（6）定量限 精密称取肉豆蔻酸异丙酯适量，加正己烷溶解定量稀释成不同倍数的系列溶液，按上述色谱条件进行测定。测得肉豆蔻酸异丙酯的定量限为0.16ng（S/N≈10）。
（7）回收率试验精密称取处方量的80%、100%、120%的肉豆蔻酸异丙酯及相应量空白基质于烧杯中，搅拌均匀，各3份，共9份；分别加正己烷6ml，充分搅拌，提取肉豆蔻酸异丙酯，重复提取3次，提取液转移至25ml容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取肉豆蔻酸异丙酯对照品约125mg，置25ml量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，精密移1ml至10ml量瓶中，正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液及对照品溶液各2µL，注入气相色谱仪，记录谱图及峰面积，外标法计算含量，结果见表1。测得平均回收率为98.96%，RSD为0.53%（n=9）。
表1 肉豆蔻酸异丙酯回收率试验结果（n =9）
2.4 样品含量测定
取本品，按含量测定方法进行测定，外标法计算供试品中肉豆蔻酸异丙酯的含量，结果见表2。
表2 睾酮凝胶中肉豆蔻酸异丙酯含量测定结果
3 讨论
3.1 色谱条件的筛选
美国药典（USP38）[5]及英国药典（BP2015）[6]均收载了肉豆蔻酸异丙酯，均采用气相色谱法测定了含量，但是色谱条件不同，见表3。
表3 美国药典（USP38）与英国药典（BP2015）色谱条件对比
我们分别按USP38和BP2015方法，取系统适应性溶液进样，记录色谱图。从试验结果来看，按USP38和BP2015方法，采用程序升温，肉豆蔻酸异丙酯峰与棕榈酸异丙酯峰的分离度大于6.0。我们根据实际情况，采用等温的方式，选择使用柱效高、分离度好、检测灵敏度高的毛细管柱，以氮气为载气。通过适当调整载气流速、检测器温度、进样口温度以及柱温等，使系统适应性试验结果符合测定要求（肉豆蔻酸异丙酯峰与棕榈酸异丙酯峰的分离度不小于6.0），且空白基质无干扰。表明采用等温方式，同样可以达到此要求，且节约分析时间，提高了试验效率。
3.2 提取次数的选择
同一批号睾酮凝胶（批号20141201）按“2.2.2”项下方法除提取次数分别为1、2、3、4、5次外，其他步骤平行操作，含量测得结果分别为0.43%、049%、0.51%、0.50%、051%。从测定结果可以看出，提取了两次即能基本提取完全。综合考虑试验结果的准确性和可操作性，选择提取次数为3次。
参考文献
[1] 林佳亮, 曾凡波, 等. 中国药师, 2005, 8(9): 757-758.
[2] 狄平平, 赵立平, 等. 中国临床药学杂志, 2009, 18(6): 354.
[3] 吴志平, 张治柳, 等. 中南林学院学报, 2000, 12, 20(4): 72-75.
[4] [英]R.C.罗，[美]P.J.舍斯基等编, 药用辅料手册(原著第四版)[S]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 359.
[5] USP(38) [S].
[6] BP(2015) [S].
*通信作者：杨清华，研究员，Tel：0531-88562281，E-mail: 632887840@qq.com