2.3　荧光离子探针的响应机制

目前，荧光化学探针的响应机制主要有以下几种：光诱导电子转移（PET）机制、分子内电荷转移（ICT）机制、荧光共振能量转移（FRET）机制、激基缔/复合物（Excimer/Exciplex）机制和刚性化效应等，现将这几种常见机制分述如下。

2.3.1　光诱导电子转移（PET）机制

在各种荧光离子化学探针主要的响应机制中，光诱导电子转移（PET）机制是最常见的一种识别机理，是指电子给体或电子受体受光激发后，处于激发态的电子给体与电子受体之间发生了电子转移。典型的PET荧光探针由三部分组成：能够键合底物的识别基团、负责光能的吸收同时能产生荧光发射信号的荧光基团，以及把识别基团和荧光基团连接起来的连接基团。当识别基团为电子给体，荧光基团为电子受体时，具体PET工作过程为：在识别基团和被测物结合之前，在光激发下，识别基团将其处于最高能级的电子转移给荧光基团空的电子轨道，导致电子无法直接跃迁回原基态轨道，从而发射不出荧光；当识别基团与底物进行结合后，给电子能力降低，光致电子转移过程被减弱或者不再发生，荧光团中被光激发的电子就能够直接跃迁回到原基态轨道，发射出强的荧光。荧光分子探针的PET作用机制可通过前线轨道理论来进行说明（如图2.8所示）。Lippard等^［5］合成了二（吡啶-2-甲基）氨基为识别基团的Zn²⁺荧光化学探针（如图2.9所示）。因为发色基团荧光素与识别基团氨基吡啶之间发生光诱导电子转移效应，此时该体系几乎没有荧光，加入Zn²⁺后，由于识别基团上N原子上的孤对电子与Zn²⁺发生配位形成了络合比为1:2的络合物，导致N原子上给电子能力降低，使得发生在氮原子和荧光团之间的PET过程受阻，体系的荧光强度大幅度增强。实验结果对此过程也进行了验证，在加入Zn²⁺之后，化合物荧光增强了77倍之多。

2.3.2　分子内电荷转移（ICT）机制

基于ICT过程的荧光分子探针通常由富电子基团（电子给体）和缺电子基团（电子受体）通过π键直接连接而成，它们之间存在推-拉电子作用，并且推电子基或吸电子基本身又作为接受体的一部分，和被分析物结合后受体的供电子部分或者拉电子部分的供拉电子能力发生改变，从而影响荧光或者吸收光谱的变化。其工作原理为（如图2.10所示）：当底物为缺电子基团（阳离子）时，如果是与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转移的程度，导致荧光光谱红移；如果是与供电子基团结合，由于孤对电子用于与阳离子形成配位键，将削弱分子内电荷转移程度，导致荧光光谱蓝移，如图2.10（a）所示；当底物是富电子基团（阴离子）时，情况正好相反，如图2.10（b）所示。一般情况下，ICT对荧光强度的影响不如PET的影响显著。

基于ICT机制，Xu等^［6］合成的化合物成功地实现了对Cu²⁺的选择性识别，结构如图2.11所示。当Cu²⁺存在时，Cu²⁺与化合物中的氮原子发生作用，大大减弱了N原子的给电子能力，从而使得荧光光谱蓝移了50nm。

ICT存在一类特殊情况叫做扭曲分子内电荷转移（TICT）。TICT是指在具有推-拉电子能力共轭体系的荧光分子中，荧光基团通过简单的单键与推电子基之间相连，当被光激发时，强烈的分子内光致电荷转移引起原来与荧光团处于共平面的电子给体绕单键旋转，而呈现出与荧光团处于相互垂直状态，原来的共轭体系从而遭到破坏，形成TICT激发态，原有的由于分子内电荷转移产生的荧光被猝灭。TICT激发态通常不发射荧光或者发射的荧光很弱，偶尔情况下ICT和TICT表现出双重荧光现象。如图2.12所示，化合物表现为双重荧光，当探针冠醚与阳离子结合后，发生了TICT，此时的长波发射强度减弱，甚至消失，以此也能显现对阳离子的识别^［7］。

2.3.3　荧光共振能量转移（FRET）机制

两个距离很近的荧光分子之间发生的能量转移机制是荧光共振能量转移（FRET）机制。它是指当一对合适的能量给体分子（Donor）和受体分子（Acceptor）相距一定的距离（一般为2～5nm），同时给体的荧光发射光谱与受体的紫外可见吸收光谱之间发生有效重叠时，激发态的电子给体将一部分或者全部的能量转移给受体，如果受体是荧光发射基团，在获得能量后发射出新的荧光，受体也可能是荧光发射猝灭剂，此时，只能看到给体的荧光变化，这种情况多用于核酸的检测。FRET过程发生与效率主要与三个因素有关：如供体的发射光谱与受体的吸收光谱之间相互重叠的程度、供体发射偶极子与受体吸收偶极子的取向以及能量供体（D）和受体（A）分子之间的距离。

Lee等^［8］基于FRET机制合成了化合物探针识别Cu²⁺，探针被420nm激发光激发后，在波长507nm处发射出丹酰基的强荧光，在加入Cu²⁺以后，罗丹明螺环结构被打开，吸收丹酰基发射的荧光从而被激发后在580nm处发射罗丹明的荧光如图2.13所示。

2.3.4　激基缔/复合物（Excimer/Exciplex）机制

如果两个相同的荧光基团（例如多环芳烃，如萘、蒽、芘等）通过一个柔性链连接在一起，当其中一个荧光基团（单体）被光激发后，和另一个处于基态的荧光基团发生相互作用形成分子内激基缔/复合物（Excimer/Exciplex）。原来的单体发射峰减弱或者消失而产生激基缔合物的强而宽的且出现在较长波长段的荧光发射峰。能否形成激基缔合物关键是需要处于基态的荧光基团和处于激发态的荧光基团之间达到相应的碰撞距离（约为3.5?）。其工作原理如图2.14所示。

如图2.15所示是一个Na⁺的荧光分子探针，它本身的荧光光谱是由单体的两个特征峰组成，当有Na⁺存在时，由于与Na⁺相互作用使得两个荧光团相互靠近，激基缔合物的荧光发射强度明显增强而单体的荧光发射强度明显降低^［9］。

2.3.5　刚性化效应

荧光分子的荧光量子产率通常和分子自身结构的刚性大小有着密切的关系。提高分子结构的刚性可有效地增强荧光发射强度，这主要是因为分子结构的刚性提高后降低了由于分子运动所引起的能量损耗，同时增加分子的共平面性后发生Frank-Condom跃迁，也有利于荧光的产生。因此也可以利用在底物存在下荧光探针分子刚性结构的增强来对底物的识别。如图2.16所示的化合物，在没有络合Zn²⁺之前，由于CN双键的异构化，分子没有完全处于同一平面，使得化合物的荧光量子产率很低，当与Zn²⁺键合后，整个分子结构的刚性增加，荧光量子产率约增强了20倍之多^［10］。

以上我们对荧光分子探针的设计原理和几种响应机制进行了介绍，后面的章节主要对本书涉及的Cu²⁺和Cr³⁺两个重金属离子的荧光探针进行简单综述。