第二节　种子扩大培养

一、种子扩大培养的目的与要求

现代发酵工业的生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米。若按5%～10%的接种量计算，就要接入几立方米到几十立方米的种子，这单靠试管里的种子直接接入是不可能达到必需的数量和质量的，必须从试管中的微生物菌种逐级扩大为生产使用的种子。菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过锥形瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。菌种种类不同，生产产品品种不同，其扩大培养的生产方法和生产条件均有所差别，如营养、温度、酸碱度等条件。因此，菌种扩大培养的目的就是为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子。种子扩大培养要根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛和数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，会使发酵生产周期缩短，设备利用率提高，对杂菌的抵抗能力增加，对发酵生产起到了关键性的作用。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度的快慢决定种子扩大培养的级数。

二、种子扩大培养的制备流程

工业化生产中，种子制备的过程实际上就是种子逐步扩大培养的过程。种子的扩大培养是成功进行发酵生产的关键。对于不同的菌种，扩大培养的要求和工艺都不一样。为生产低成本、高质量的产品，需要根据工业化生产需求制订科学的扩大培养工艺，采用科学的手段对扩大培养的整个过程进行监测和控制。

种子制备包含两个阶段：实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段，如图2-1所示。

（一）实验室种子制备阶段

实验室种子制备一般采用孢子的制备和液体种子制备两种方式。对那些产孢子能力强、孢子发芽生长繁殖快的菌种，可以采取在固体培养基上培养的方法，孢子可直接接入种子罐，从而简化了操作，减少了操作步骤，同时也减少了染菌的机会。

1.孢子的制备

（1）细菌孢子的制备　细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃，培养时间一般为1～2d，产芽孢的细菌培养则需要5～10d。

（2）霉菌孢子的制备　霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养温度一般为25～28℃，培养时间一般为4～14d。例如生产青霉素的产黄青霉菌，采用大米或小米作为固体培养基，取一定量装入250mL茄子瓶中进行灭菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能黏也不能散，灭菌冷却后接入孢子悬浮液，在25～28℃培养4～14d。培养期间，还要经常翻动，保持通气均匀。培养结束后，接入种子罐，或以真空抽去水分至10%以下，于4℃冰箱中保存备用。

（3）放线菌孢子的制备　放线菌孢子的培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃，培养时间为5～14d。

2.液体种子制备

（1）好氧培养　对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌都采用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，在摇床上恒温振荡培养，生长出的菌丝体作为种子。其过程为：试管→锥形瓶→摇床→种子罐。

不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属，以32℃培养18～24h的斜面移入250mL茄子瓶斜面培养基上，或在摇瓶培养基上，于32℃培养12h后可接入种子罐。

（2）厌氧培养　对于酵母菌（生产啤酒、葡萄酒等），其种子的制备过程为：试管→锥形瓶→卡氏罐→种子罐。

例如，生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基斜面上，4℃冰箱保藏。3～4个月移种一次，再接种至10mL麦芽汁试管中，25～27℃保温培养2～3d后，移至含250mL麦芽汁的500mL锥形瓶或含500mL麦芽汁的1000mL锥形瓶中。25℃培养2d，再移至含5～10L麦芽汁的卡氏罐中，15～20℃培养3～5d，再接入发酵罐，因是好氧性菌（菌体增殖期间），所以要通气。

具体流程如下：

斜面10mL试管500～1000mL锥形瓶
（250～500mL麦芽汁）含5～10L麦芽汁的卡氏罐发酵罐

（二）生产车间种子制备阶段

种子罐扩大培养，一般在生产现场操作。

实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气、搅拌等，使菌体适应发酵环境。种子罐的接种方法一般根据菌种种类而异。孢子悬浮液一般用微孔接种法接种，摇瓶悬浮液种子可在火焰保护下接入种子罐，也可以用差压法接入。种子罐之间或种子罐与发酵罐之间的移种，主要用差压法，通过种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接收罐表压降为零，因为无压会引起染菌。

1.种子罐的作用

种子罐的作用主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。

2.种子罐级数的确定

种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特性、孢子发芽速度和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。为保证种子细胞变异少、衰老细胞所占比例较小，制备种子逐级扩大培养的次数是有严格限定的。对于生长快的细胞，种子用量的比例小，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少。如谷氨酸生产中，茄子瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10h，菌体浓度达到10⁸～10⁹个/mL，即可作为种子接入发酵罐，这称为一级种子罐扩大培养，也可叫作二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌，其孢子悬浮液接入一级种子罐于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的二级种子罐于27℃培养10～24h，菌丝迅速繁殖，获得粗壮菌体，此菌丝可移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也可称为三级发酵。一般50m³发酵罐都采取三级发酵。如果是实验室的中试（5～30L），可以直接将孢子或菌体接入罐中发酵，即一级发酵。

为了更有效地实现发酵菌体质和量的积累，种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，而且可以减少多次移种可能发生的染菌机会。当然，也要考虑尽可能地延长菌体在发酵罐中生产产物的时间，缩短种子增殖的非生产时间，提高发酵罐的生产率［产物/（mL·h）］。此外，种子罐的级数也可通过改善工艺条件，改变种子培养条件，加速菌体的增殖而改变。

3.确定种子罐级数需要注意的问题

（1）种子罐的级数愈少，愈有利于简化工艺，便于控制。

（2）种子罐级数太少，接种量少，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。

（3）种子罐的级数由产物的品种及生产规模而定，也随着工艺条件的改变做适当的调整。例如，改变种子罐的培养条件、加速孢子的发育或改进孢子瓶的培养工艺后可大大增加孢子数量等，在此基础上均有可能使三级发酵简化为二级发酵 。

三、影响种子质量的主要因素

菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养，影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子罐的级数和接种量控制等。种子罐培养除了根据菌种特性或生产条件恰当选择外，还应为菌种的生长创造一个最合理的培养条件。

1.培养基

培养基是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。不同微生物对营养的要求不一样，但它们所需的基本营养大体上是一致的，其中以碳源、氮源、无机盐、生长素和金属离子等最重要。不同类型的微生物所需要的培养基成分与浓度配比并不完全相同，必须按照实际情况加以选择。提高产量是选择培养基的一个重要标准，但同时还应当要求培养基组成简单、来源丰富、价格便宜、取材方便等。一般来说，种子罐是培养菌体的，培养基的糖分要少，而对微生物生长起主导作用的氮源要多，且其中无机氮源所占的比例要大些。种子罐和发酵罐的培养基成分相同，使处于对数生长期的菌种移植在适宜的环境中发酵，可以大大缩短其生长延滞期。其原因是执行代谢活动的酶系已经形成，可立即实施代谢功能，不需花费时间另建适宜新环境的酶系。因此，种子罐和发酵罐的培养基成分趋于一致较好，但各成分的数量（即原料配比）需根据不同的培养目的各自确定。任何生产所用培养基都没有一个可完全确定的配比，对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的配比应进行多因素的优选，通过对比试验来确定。如果菌种的特性或设备条件（如罐型、搅拌的形式和转速等）变化较大，则培养基的配比应通过试验相应地变更。只有培养基各成分的关系选得比较恰当，才能最大限度地发挥菌种的特性，提高产量。

2.接种龄和接种量

接种龄和接种量是种子制备过程中重要的控制指标。

接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此，选择适当的接种龄是一个至关重要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，即对数生长期最合适。如果种子过于年幼，接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物开始形成的时间推迟，而过老的种子也会出现生产能力下降而使菌体自溶的现象。对于不同菌种、不同产品品种、不同工艺条件，其接种龄也不相同，具体的生产，接种龄要进行多次试验，从发酵产品产量的多少，即产率大小来确定最适接种龄。

接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体积的比例。抗生素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为7%～15%或更多。啤酒生产发酵的接种量为5%～10%，谷氨酸发酵接种量仅为1%。接种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体数达到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类，种子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生长优势，可以相对减少杂菌污染的机会。但接种量太大，也会造成菌体生长过速，溶解氧跟不上，从而影响产物的合成。

3.温度

温度对微生物的影响，不仅表现在对菌体表面的作用，而且因热平衡的关系，热传递至菌体内，对菌体内部所有的物质都有作用。由于生物体的生命活动可以看作是相互连续进行的酶反应，任何化学反应又都和温度有关，通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快1倍，所以温度直接影响酶反应，进而影响着生物体的生命活动。对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶活性。任何微生物的生长都需要有适宜的生长温度，在此温度范围内，微生物生长、繁殖最快。大多数微生物的最适生长温度在25～37℃范围内，细菌的最适生长温度大多比霉菌高些。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长、繁殖，可减少污染杂菌的机会，减少夏季培养所需降温的辅助设备，对工业生产有很大的好处。

温度和微生物生长的关系：一方面在其最适温度范围内，生长速度随温度升高而加快；另一方面，不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。处于缓慢期的细菌对于温度的影响十分敏感，将其置于最适生长温度附近，可以缩短其生长的缓慢期；将其置于较低的温度，则会延长其缓慢期。孢子萌发的时间在一定温度范围内也随温度的上升而缩短。处于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，其升温的破坏作用也显得较弱，因而在最适生长温度范围内，组成菌体的蛋白质很少变性，所以在最适温度范围内适当提高对数生长期的培养温度，既有利于菌体的生长，又能避免热作用的破坏。处于生长后期的细菌，一般来说其生长速度主要取决于溶解氧而不是温度，因此在培养后期可适当提高通气量。此外，不管微生物处于哪个生长阶段，每种微生物都有自己的最高生长温度和最低生长温度。为了使种子罐培养温度控制在一定的范围，生产上常在种子罐上安装热交换设备，如夹套、排管或蛇管等进行温度调节，冬季进风时还需加热。

4.pH值

培养基的氢离子浓度对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可随pH值的改变而产生不同程度的变化。例如，黑曲霉合成柚苷酶时，培养基在pH 6.0以上的环境中，果胶酶活性受到抑制，pH值改变到6.0以下就形成果胶酶，且酶系组成由pH值决定。泡盛酒曲霉突变株在pH 6.0条件下培养时以产生α-淀粉酶为主，糖化型淀粉酶与麦芽糖酶产生极少，在pH 2.4条件下培养，转向糖化型淀粉酶与麦芽糖酶的合成，α-淀粉酶受到抑制。

由此可见，培养基的pH值与微生物生命活动和酶系组成关系十分密切。培养基pH值在发酵过程中能被菌体代谢所改变，阴离子（如醋酸根、磷酸根）被吸收或氮源被利用后NH₃的产生，使pH值上升；阳离子（如、K⁺）被吸收或有机酸的积累，使pH值下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH值转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH值转移，这都跟碳氮比直接相关。因此，培养基必须保持适当的pH值，而调节pH值的方法有三种，即使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂（如生理酸性与生理碱性的盐类）。

5.通气与搅拌

好氧菌或兼性需氧菌的生长与合成酶都需要供给氧气。不同微生物要求的通气量不同，即使是同一菌种，在不同生理时期对通气量的要求也不相同。因此，在控制通气条件时，必须考虑到既能满足菌种生长与合成酶的不同要求，又要节省电耗，以提高经济效益。通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度较一致，有利于营养物质和代谢物质的分散。此外，选用挡板可使搅拌效果更好。通气量与菌种、培养基的性质以及培养阶段有关。在培养阶段的各个时期究竟如何选择通气量，要根据菌种的特性、罐的结构、培养基的性质等许多因素，通过试验确定。通气量的多少，最好按氧溶解的多少决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧速度时，菌体才能正常地生长和合成酶，否则氧的溶解比消耗少，氧的浓度降低，降到某一浓度（称溶解氧的临界点）时，菌体生长就减慢。因此，随着菌体繁殖、呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。一般来说，培养罐深、搅拌转速大、通气管开孔面积小或数量多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度也就大，且在这些因素确定的条件下，培养基的黏度越小，氧的溶解速度也越大。因此，根据罐的结构考虑培养液的黏度，增加一定的通气量，可以达到菌体所需的溶解氧，满足菌体呼吸的需要。

搅拌可以提高通气效果，促进微生物的繁殖，但是剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，液膜表层的酶容易氧化变性，损伤微生物细胞，同时泡沫过多将增加杂菌污染的机会。

6.泡沫

菌种培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关。泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵。此外，由于泡沫大量地产生，致使培养液的容量一般只是种子罐容量的一半左右，大大影响设备的利用率，甚至发生跑料现象，导致染菌，使损失更大。

在菌种培养过程中产生泡沫的原因是很多的。通气、机械搅拌使液体分散和空气窜入形成气泡，培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡，培养基中某些成分（如蛋白质及其他胶体物质）的分子在气泡表面排列形成坚固的薄膜，不易破裂，聚成泡沫层。

对菌种培养过程的消泡措施的研究，主要偏重于化学消泡和机械消泡，并取得了一定的进展。微生物工业目前使用的消泡剂，有各种天然的动植物油以及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等，这类消泡剂往往因培养液的pH值、温度、成分、离子浓度以及表面性质的改变，在消泡能力上呈现很大的差别，在培养液内残留量也高，给净化处理造成不同程度的困难。而新型的有机硅聚合物如硅油、聚硅氧烷树脂等，则具有效率高、用量省、无毒性、无代谢性，同时兼有提高微生物合成酶活性等多种优良特性，是一类有发展前途的消泡剂。泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。例如，在培养基配料中增加磷酸盐已在某些场合收到实效，可使消泡剂添加量大幅降低。

7.染菌的控制

染菌是微生物发酵生产的大敌，一旦发现染菌，应及时进行处理，以免造成更大的损失。如果不是设备本身结构存在“死角”，染菌的原因归纳起来主要包括设备、管道、阀门漏损，灭菌不彻底，空气净化不好，无菌操作不严或菌种不纯等。因此，要控制染菌继续发展，必须及时找出染菌的原因，采取措施，杜绝染菌事故再现。菌种发生染菌会使各个发酵罐都染菌。因此，必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。如果新菌种不纯，则需反复分离，直至完全纯粹为止。对于已出现杂菌菌落或噬菌体噬斑的试管斜面菌种，应予以废弃。在平时应经常分离试管菌种，以防菌种衰退、变异和污染杂菌。对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制，对种子质量更要严格掌握，必要时可将种子罐冷却，取样做纯菌试验，确认种子无杂菌存在，才能向发酵培养基中接种。

四、种子质量的控制措施

种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率来体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌侵入，从而获得优良的种子。因此，在生产过程中通常进行以下两项检查。

1.菌种稳定性的检查

生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入锥形瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。

2.杂菌检查

在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察或平板培养试验（即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检）。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度，pH变化，溶解氧利用情况，色泽、气味是否异常等。

由于菌种在种子罐中的培养时间较短，使种子的质量不容易控制，因此可分析的参数不多。一般在培养过程中要定期取样，测定其中的部分参数来观察基质的代谢变化以及菌体形态是否正常。例如酒精酵母的种子罐，一般定时测酸度变化、还原糖含量、耗糖率且进行镜检等，镜检内容包括测酵母细胞数、酵母出芽率、酵母形态（整齐、大小均匀、椭圆形或圆形）、是否有杂菌等。酶活力来判断种子的质量是一种新的判断，如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，种子液淀粉能力强（淀粉酶活力高），则接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。因此，在选用种子时，用测定种子液中淀粉酶的活力来判断种子质量的方法是可行的。

五、种子质量标准

发酵工业上常见的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群。种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力，种子质量的评价通常从细胞或菌体的形态、生化指标、产物生成量、酶活力这几个方面进行。

1.细胞或菌体形态

主要考察菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）。对于细菌、酵母菌等单细胞生物来说，要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；对于霉菌、放线菌，要求菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分支情况和内含物情况好。

2.生化指标

生化指标包括种子液的糖、氮、磷的含量和pH值变化。

3.产物生成量

在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。

4.酶活力

种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。