第五节　细胞因子及其受体与黏附分子的检测技术

一、细胞因子及其受体检测技术

（一）细胞因子检测

细胞因子检测的方法主要有生物学、免疫学和分子生物学测定法。分子生物学测定法检测细胞因子生物学活性，其结果以活性单位（U/mL）表示；免疫学测定法检测细胞因子蛋白质含量，其结果以纳克每毫升（ng/mL）或皮克每毫升（pg/mL）表示；分子生物学测定法是从细胞因子基因水平检测DNA和mRNA。各种检测方法不能相互替代，联合使用三种检测方法分析细胞因子才能更加全面、科学。

1.生物学检测法

应用一定的指示系统（例如细胞）与已知活性的细胞因子标准品或待测标本相互作用。以指示系统的变化（细胞增殖、死亡或分泌蛋白等）来显示细胞因子功能，将待测标本与标准品进行比较，分析待检标本中的细胞因子水平。根据指示系统的表现不同，生物学检测法可分为细胞增殖法、靶细胞杀伤或抑制法、细胞病变抑制法、趋化活性测定法等。

（1）细胞增殖法　为最常用的细胞因子生物学活性测定方法，可用于白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）等多种白细胞介素的测定。细胞增殖法是利用某一细胞因子可促进相应指示细胞分裂、增殖的特性而建立的。将不同浓度的细胞因子（标准品或待检样品）与指示细胞共同孵育一定时间，检测细胞增殖情况（例如：细胞涂片染色镜下形态学观察、MTT比色法、³H-TdR掺入法等），细胞增殖程度与细胞因子活性成正比。

（2）靶细胞杀伤或抑制法　主要用于肿瘤坏死因子的测定。肿瘤坏死因子（TNF-α、TNF-β）具有杀伤肿瘤细胞的作用，检测TNF活性可采用靶细胞杀伤法。选择对TNF敏感的细胞株作为靶细胞，使其与不同稀释度的标准品或待测样品共同培养一定时间，检测细胞毒性反应的程度，细胞毒性反应程度与TNF活性成正比关系。

（3）细胞病变抑制法　主要用于检测干扰素。干扰素（IFN）可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶类，保护宿主细胞免受病毒感染，从而抑制细胞病变。将指示细胞、病毒和IFN标准品或待测样品置同一反应体系中，培养一段时间后，检测细胞的病变程度，细胞病变程度与IFN活性成反比关系。

（4）趋化活性测定法　主要用于趋化性细胞因子的测定，如白细胞介素8（IL-8）等，以Boyden小室法最为常用。Boyden小室由上、下两室组成，下室为一盲端，两室间用一层硝酸纤维素膜分隔。当下室加入IL-8或待测样品、上室加入细胞时，IL-8在膜的两侧形成浓度梯度，细胞在趋化因子作用下向下室移动。根据迁移细胞的多少和细胞类型判断趋化活性的强弱和性质。

2.免疫学测定法

细胞因子的化学本质是蛋白质或多肽，很容易制备相应的抗体，用已知抗体便可以检测未知的细胞因子（抗原）。

（1）体液中细胞因子的检测

①生物素-亲和素系统的双抗体夹心ELISA法：制备两种识别同一细胞因子不同表位的单克隆抗体，其中一种作为包被抗体，另一种作为标记抗体进行双抗体夹心ELISA。但体液中细胞因子的含量很低，常规ELISA的敏感度不能达到要求，实际工作中常用生物素标记一种抗体、亲和素标记的辣根过氧化物酶来实现抗原抗体反应系统与酶-底物显色系统的偶联，使抗原抗体反应的信号得以放大。以白细胞介素-2（IL-2）检测为例：以抗人IL-2单克隆抗体包被于聚苯乙烯反应板上，加入待测抗原（血清、体液标本）或标准品与固相抗IL-2单抗结合，再加入生物素化抗IL-2抗体，最后形成抗IL-2抗体-IL-2-生物素化抗IL-2抗体复合物，依次加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉素亲和素、酶底物/色原溶液后呈色，显色（吸光度）强度与待测标本中IL-2水平在一定范围内呈正相关。

②放射免疫分析：将特异性细胞因子抗体包被于放射免疫分析试管中，用¹²⁵I标记在细胞因子上。检测时，先加入标准品或待测样品，反应一段时间后再加入标记的细胞因子，如样品中有细胞因子存在，即可竞争性抑制标记的细胞因子与包被抗体结合。样品中细胞因子水平与抑制程度相关，最后通过标准曲线得到样品中细胞因子的含量。

③抗体芯片技术：将特异性细胞因子抗体按预定的顺序和阵列形式排列在芯片上，将待测标本稀释，与之反应，再加入荧光标记抗体，用计算机软件对荧光信号进行分析，即可获得准确的结果。抗体芯片技术一次能同时检测多种细胞因子，灵敏度高，多数可达皮克（pg）水平，样品用量少，特异性好。

④酶联免疫斑点试验：从单细胞水平检测细胞因子分泌细胞的一项细胞免疫学检测技术。先将抗细胞因子抗体包被于固相载体上，再加入不同来源的细胞（待检细胞），与特异性刺激物如多肽、基因表达产物或提取抗原等经一段时间孵育后，细胞分泌细胞因子并与固相抗体发生结合；此时洗涤去除细胞，然后再相继加入相应的酶标抗体和底物，孵育、显色形成斑点。用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位记录结果。每一个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞。

（2）细胞内细胞因子的检测　主要用于Th细胞亚群的测定，常检测的细胞因子包括IFN-γ、IL-4等，常用的方法是流式细胞术。此法不需要体外长时间培养、纯化细胞，但需要使用破膜剂进行破膜预处理，不仅可确定分泌特定细胞内细胞因子的细胞数量、比较细胞内细胞因子水平，而且还可确定分泌特定细胞因子的细胞表面标志。但是由于染色破膜的细胞为死亡细胞，难以再进行后续的功能实验。

使用体外多克隆激活剂（佛波酯、离子霉素或特定的抗原等）激活细胞，同时加入细胞内高尔基体介导的蛋白转运抑制剂（莫能星、布雷菲德菌素A），抑制细胞因子释放至细胞外，从而使产生的细胞因子在胞质内蓄积，信号增强。经多聚甲醛固定和皂角苷破膜增加细胞膜通透性后，加入荧光素标记细胞因子抗体孵育一定时间，洗涤去除游离的标记抗体，再通过流式细胞仪进行分析。

3.分子生物学检测法

分子生物学检测即从基因水平对细胞因子DNA和mRNA测定。

（1）细胞因子DNA检测　目的在于分析细胞因子基因有无缺失、突变或对细胞因子的基因多态性进行分析。

①Southern印迹杂交：首先提取基因组DNA，经限制性核酸内切酶酶切，再将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。电泳后，将琼脂糖凝胶中DNA变性，并将DNA区带转至硝酸纤维素膜上，最后用相应细胞因子的核酸探针进行核酸杂交，测定该细胞因子特定DNA序列结构。

②斑点印迹杂交：将提取的基因组DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用相应细胞因子的核酸探针进行核酸分子杂交。若待检标本中存在相应细胞因子的基因序列，将会与探针形成杂交链，洗涤去除游离的探针分子，最后通过一定方式检测探针信号。斑点印迹杂交操作简便、标本用量少且可同时进行大量标本测定，但不能确定基因分子量。

③聚合酶链反应（PCR）：应用PCR检测细胞因子DNA的基本过程是构建序列特异性引物、提取基因组DNA进行PCR扩增、收集扩增产物进行分析，可采用琼脂糖凝胶电泳进行限制性片段长度多态性分析。

④原位杂交和原位PCR：可对某一特定组织细胞的细胞因子DNA进行分析，分析某些细胞因子DNA的突变或缺失。

原位杂交是标记含互补序列的DNA或RNA片段（探针）在适宜条件下与细胞染色体上特定的DNA形成稳定的杂交体，再通过免疫组织化学技术的方法检测探针分子的标记信号；如探针分子上标记有地高辛分子，便可通过抗地高辛抗体和酶标第二抗体得以显示。

原位PCR是将PCR反应所需各种试剂通过细胞膜或核膜进入细胞内或核内，以组织细胞内的DNA或RNA为模板，在原位进行DNA扩增。扩增产物因分子较大不易透过细胞膜而保留于原位，最后通过分子杂交技术得以检测。

⑤荧光定量PCR：可以对细胞因子DNA进行定量或半定量测定。基本过程是设计引物和探针、选择管家基因、制作标准曲线、荧光定量PCR，确定转录标本之间起始拷贝数的差异进行相对定量，或通过标准曲线来确定转录标本的起始拷贝数。

（2）细胞因子mRNA表达的测定　mRNA的检测广泛应用于免疫反应及炎症反应过程中细胞因子表达水平的检测。常用的细胞因子mRNA检测法有Northern印迹（Northern blot）、RT-PCR、核糖核酸酶保护分析（RPA）等方法，但都有其局限性。随着分子生物学的不断发展，低丰度细胞因子mRNA含量检测（Quantikine mRNA）、实时荧光定量PCR技术取得了较大发展并应用于临床。

①低丰度细胞因子mRNA含量检测法：是一种对低丰度细胞因子mRNA进行定量的新方法，生物素和地高辛标记的探针在杂交板中与靶mRNA或者标准mRNA杂交，杂交后的产物转移至链霉亲和素包被的板孔中，杂交后靶mRNA被捕获，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，然后加入碱性磷酸酶底物显色，酶标仪读取结果。

②实时荧光定量PCR技术：通过对逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增反应中每一个循环生物荧光信号的实时检测，实现对起始模板的定量及定性分析。

（二）细胞因子受体检测

细胞因子受体测定包括膜受体测定、体液中可溶性细胞因子受体的测定。

1.膜结合受体的检测

绝大多数可用常规免疫组织化学染色方法或通过流式细胞仪进行测定，也可采用活细胞吸收试验，即将过量的待测细胞与限量细胞因子共同孵育，若细胞表面存在相应受体便可与细胞因子结合，离心收集上清液，检测吸收前、后细胞因子活性，通过细胞因子生物活性被中和的情况，便可推测细胞表面受体的表达情况。

2.可溶性受体的检测

可溶性细胞因子受体存在于体液中，具免疫原性，可制备特异性抗体，再通过免疫化学方法进行检测，常用生物素-亲和素系统的双抗体夹心ELISA法。

（三）常见细胞因子及其受体检测的临床意义

1.白细胞介素-2（IL-2）

IL-2升高可见于肿瘤、心血管病、肝病、器官移植后早期排斥反应等。IL-2降低可见于多种原发性、继发性免疫缺陷病，例如：系统性红斑狼疮、麻风、艾滋病等。

2.白细胞介素-4（IL-4）

IL-4升高可见于硬皮病、多发性硬化、自身免疫甲状腺疾病、炎性肠道疾病、支气管哮喘和特异性皮炎等超敏反应性疾病等。

3.白细胞介素-6 （IL-6）

IL-6升高可见于浆细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、Lennert淋巴瘤、霍奇金病、心脏黏液瘤、宫颈癌、术后、烧伤、急性感染、器官移植排斥反应等。

4.白细胞介素-8（IL-8）

IL-8升高可见于类风湿关节炎、麻风、肺纤维化、呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、支气管扩张、败血症休克、内毒素血症、输血溶血反应、酒精性肝炎、胃炎、炎症性结肠炎、急性脑膜炎球菌感染等。

5.白细胞介素-10（IL-10）

IL-10升高可见于肾小球疾病、慢性肾衰竭、类风湿关节炎、器官移植排斥反应、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、基底细胞癌、肺癌、结直肠癌等。

6.白细胞介素-17（IL-17）

IL-17升高可见于类风湿关节炎、多发性硬化、哮喘、系统性红斑狼疮、移植排斥反应等。

7.干扰素-γ（IFN-γ）

（1）IFN-γ与感染　IFN-γ能诱导细胞对病毒感染产生抗性。

（2）IFN-γ与肿瘤　恶性实体瘤、细胞免疫缺陷（艾滋病等）患者外周血淋巴细胞产生干扰素的能力明显降低。

（3）IFN-γ与自身免疫性疾病　自身免疫性疾病患者血清中IFN-γ水平明显上升，例如：类风湿关节炎、硬皮病、活动性红斑狼疮等；而非自身免疫性疾病患者血清中很少能查到IFN-γ改变，因此血清IFN-γ水平测定能区分是否患自身免疫性疾病，以及了解疾病的活动期。

8.肿瘤坏死因子-α（TNF-α）

TNF-α与许多疾病密切相关，例如：哮喘、克罗恩病、类风湿关节炎、神经性疼痛、肥胖症、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等。但TNF-α异常不具有疾病特异性，对血清或体液中TNF-α浓度的检测不能作为鉴别诊断疾病的特异指标，但可作为疾病病情变化、治疗效果以及预后判断的评价指标。

9.可溶性白细胞介素-2受体（sIL-2R）

sIL-2R升高可见于白血病及淋巴系统恶性疾病、肿瘤、艾滋病与其相关的免疫缺陷疾病、病毒感染性疾病、器官移植后排斥反应、自身免疫性疾病等。

10.转化生长因子-β（TGF-β）

TGF-β在血清或体液中的升高或降低并无疾病特异性，不能作为疾病诊断与鉴别的特异指标，但其异常水平可用为临床判断机体代谢、炎症反应、纤维化等的非特异性指标之一，对肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应等相关疾病有重要提示作用。

二、黏附分子的检测技术

（一）检测方法

黏附分子是介导细胞间及细胞与细胞外基质间黏附作用的分子，化学本质为蛋白质，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。

1.细胞表面黏附分子的检测

（1）放射免疫测定法　通常用抗细胞黏附分子抗体包被载体，加受检样品后，再加相应单克隆抗体和同位素标记的二抗作非竞争性固相放射免疫测定法。

（2）酶免疫组织化学法　将酶标记的抗特定黏附分子抗体加入到组织切片标本，加入酶底物显色后显微镜下观察结果。

（3）荧光免疫组织化学法　把组织中的黏附分子作为抗原，与抗黏附分子的单抗（一抗）反应，再与荧光素标记的抗体（二抗）结合，或直接与荧光素标记的一抗反应，将采集的标本常规制备组织切片，通过荧光显微镜对黏附分子进行定性分析。

（4）流式细胞术　可用于内皮细胞、淋巴细胞等细胞表面黏附分子的测定。

（5）时间分辨荧光免疫测定法　可用于内皮细胞、淋巴细胞等细胞表面黏附分子的测定，检测灵敏度高，可同时用于多种黏附分子的测定。

（6）酶免疫显色测定法　将酶标记的抗特定黏附分子抗体加入到细胞标本中，加入酶底物显色后显微镜下观察结果。

（7）酶免疫化学发光测定法　将酶标记的抗特定黏附分子加入到细胞标本中，再加入酶的发光或荧光底物，使用相应的发光检测仪或荧光检测仪进行检测。

2.可溶性黏附分子的检测

（1）双抗体夹心ELISA测定法　用特定黏附分子的抗体包被聚苯乙烯微孔板表面，洗涤后用牛血清白蛋白封闭固相载体表面，然后加入一定量的相应待测标本；温育后洗板，再加入酶标的特异性抗黏附分子抗体，洗涤后加入酶底物显色测定，颜色反应的深浅与标本中黏附分子含量成正比。将待测标本的吸光度与标准曲线比较，即可得标本中待测黏附分子含量。

（2）流式细胞术多指标高能量检测技术　4.4μm和5.5μm两种大小的微球内部分别标记9种、11种不同强度的荧光染料，构成了20种可以同时被流式细胞仪加以识别和区分的不同微球，故可以同时在同一份标本中进行多达20种指标的检测，可用于多种可溶性黏附分子检测。

3.黏附分子基因及基因表达的检测

（1）黏附分子基因的多态性测定　可用PCR-SSCP、PCR-RELP、PCR-ASO、PCR-SSO、PCR-SSP、实时荧光PCR、PCR-DNA测序等方法进行检测。

（2）黏附分子基因表达的测定　可使用Northern blot、逆转录PCR（RT-PCR）方法。

（二）临床意义

1.E-钙黏素

胃活检组织的E-钙黏素免疫组织化学染色可作为胃腺癌及其分化程度的早期辅助诊断指标，若组织标本中E-钙黏素化学染色阴性，提示预后不良。

2.CD44

过量表达的CD44变异体与肿瘤的发生和侵袭有关，预示患者体内有肿瘤转移的危险。

3.LFA-1

LFA-1的合成障碍与先天性细胞黏附缺陷病相关。

4.ICAM-1

局部组织上皮细胞或血管内皮细胞ICAM-1表达增多，与类风湿关节炎、支气管哮喘、多发性硬化症等免疫炎症发生相关。

5.可溶性VCAM-1

可溶性VCAM-1升高可见于肝病、转移癌、某些自身免疫病、寄生虫感染、深静脉血栓等。

6.可溶性E-选择素

可溶性E-选择素增高可见于糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、败血症、结节性多动脉炎、巨大细胞动脉炎等疾病。

7.可溶性L-选择素

可溶性L-选择素升高与败血症、艾滋病感染等相关。

8.可溶性P-选择素

可溶性P-选择素升高可见于溶血性尿毒症、血小板减少性紫癜等患者。