3.6.1 堆肥中的微生物及其研究方法
3.6.1.1 堆肥微生物的种类
好氧堆肥是在有氧条件下，利用堆体中的土著菌或人工接种微生物菌剂，使可降解有机物质向腐殖质转化，并使其稳定化的过程，它是一种实现有机废物资源化的重要技术。在好氧堆肥过程中，有机物的降解是在微生物群体及其分泌的酶共同作用下进行的，微生物是堆肥作用的主题［98，99］。从生物学的角度分析，可以把堆肥微生物分为细菌、放线菌、真菌（包括霉菌和酵母菌）和病原体等。根据微生物对不同温度条件的耐受能力，还可以把堆肥微生物分为嗜冷微生物（0～25℃）、嗜温微生物（25～45℃）和嗜热微生物（>45℃）［100］。
（1）细菌
大量的研究表明：细菌是堆肥过程中数量最大、最普遍的微生物群体，在堆肥过程中发挥着重要作用，堆肥升温期的嗜温性细菌非常活跃，对有机质、糖、蛋白质等容易降解的有机物进行分解，有利于发酵温度的快速升高；随着堆肥化的延续，堆肥温度的升高，嗜温性细菌生物活性受到抑制甚至死亡，在堆肥的高温阶段细菌的总量减少，存活的都是高温细菌；降温期嗜温性细菌又开始活跃。目前，在堆肥过程中检测到的细菌种属有Aneurinibacillus、Lactobacillus、Themus thermophilic、Xanthomonas campestris、Brevibacillus、Hysrogenobacter spp.、Saccharococcus themophilus、Rhodococcus、Rhodotheermus marinus、Actinobacteria、Thermophilic Baacillus、Saccharomonospora、Pseudomonas、Gordonia、Corynebacterium、Clostridium thermolacticum、γ-Proteobacteria等。芽孢杆菌属细菌是堆肥高温阶段的主要作用菌群，它们依靠高温阶段形成芽孢来抵抗高温，如枯草芽孢杆菌属（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌属（B.licheniformis）、环状芽孢杆菌属（B.circulans）等。
（2）放线菌
放线菌是具有丝状分支结构的原核微生物，由于放线菌的菌丝具有较强的机械穿插作用，能对堆体中的木质纤维类物质进行降解，研究表明，放线菌是堆肥高温期的主要优势菌群［101］，由于放线菌的G+C含量较一般细菌高，其耐热能力较强，在堆肥体系有机物的降解过程中发挥着重要作用，尤其是对于堆肥高温期的木质纤维素的降解起着至关重要的作用。同时，由于放线菌能够形成孢子来抵抗不利环境，是高温时期的优势菌群，其中包括诺卡氏菌（Nocardia）、链霉菌（Streptomyces）、高温放线菌（Thermoactinomyces）和单孢子菌（Micromonospora）等，它们除了继续分解易分解的有机物外，还对半纤维素、纤维素等难降解有机物起到了降解作用，有利于堆肥的腐殖化进程。
（3）真菌
虽然真菌是地球上的主要降解者，但在堆肥过程中发挥的作用却不如细菌。由于真菌的耐高温能力较差，在堆肥过程中堆体自身散发热量使堆温升高以致真菌难以存活，当温度高于65℃时大部分的真菌容易发生自燃［102］。真菌主要出现在堆肥初期和中温期，嗜温性真菌地霉菌（Geotrichumsp）和嗜热性真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是堆肥生料中的优势种群。研究表明嗜温性白腐真菌能够分泌胞外木质素降解酶系，对木质素具有很强的降解能力［103］，其他一些真菌，如担子菌（Basidiomycotina）、子囊菌（Ascomycotina）、橙色嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）也具有较强的分解木质纤维素的能力。因此，真菌的存在对于堆肥物质的腐熟具有非常重要的意义。
3.6.1.2 接种微生物强化堆肥研究进展
在堆肥过程中，微生物起着重要的作用，因此，微生物强化接种堆肥中的微生物学研究也就至关重要［104］。早在20世纪40～50年代，美国就已经开始尝试通过接种微生物菌剂和堆肥物料回流的方式来缩短堆肥周期，以达到加快堆肥进程的目的。近年来，随着国内外微生物研究的不断深入，推动了微生物强化接种堆肥理论研究的进步。针对不同的堆肥原料，从接种单一微生物菌剂到接种高效复合微生物菌剂堆肥，人们做了大量的研究探索，李秀艳［105］、胡菊［106］、王利娟［107］等的研究表明：在堆肥过程中人工接种微生物菌剂可以增加堆层中微生物总数，增强堆体中微生物生态系统的功能，使堆体中不稳定的有机物得到更好的降解，进而达到了提高堆肥效率和堆肥产品质量的目的。赵小蓉［108］、席北斗［109］、程刚［110］等对微生物强化接种堆肥进行了研究，研究表明，单一的微生物群体，无论其活性多高，在提高堆肥效率上都不如多种微生物群体的协调作用。在堆肥过程中接种高效复合微生物菌剂，不仅可以增加堆体中微生物量，还可以减少菌群之间的拮抗性，充分发挥复合微生物菌群的相互协同作用，有助于物料的高效降解，使堆肥充分腐熟，提高堆肥效率。席北斗等［5］根据不同比例配置的复合菌剂的产酶能力的大小，从5组复合微生物菌剂中优选出一组高效复合微生物菌剂V其配比为：康氏木霉：白腐菌∶变色栓菌∶EM菌∶固氮菌∶解磷菌∶解钾菌=15∶15∶15∶25∶10∶10∶10。随后，席北斗等［12］又用筛选的复合微生物菌剂V，对微生物强化接种堆肥技术进行了研究。结果表明，在原料配比一定的情况下，与接种等量灭活菌的对照组相比，接种复合微生物菌剂的堆肥体系的微生物量较高，不仅能控制臭气的产生，还能提高堆肥效率，使堆肥腐熟度得到提高。於林中等［111］研究了产物接种对生活垃圾水解/好氧复合生物预处理的影响，结果表明，在复合生物预处理过程中产物接种加剧了水解阶段的酸化抑制效应，减少了细菌数量并降低了相关水解酶活性，产物接种可促进纤维素分解菌的生长繁殖，提高CMC酶、滤纸纤维素酶的活性，从而有利于难降解生物质的分解。王慧杰等［112］利用传统培养方法研究微生态调节剂对猪粪堆肥过程中的微生物生理群的影响时发现，接种ZZMZ堆肥微生态调节剂可以激发堆体中微生物的生长繁殖，使堆体中微生物总数呈现明显的升高趋势，可以提高堆体中的细菌和放线菌总数，但会使真菌的数量下降。王慧杰等［113］又利用传统培养方法研究微生态调节剂对猪粪堆肥过程中微生物生理群的影响，结果发现接种ZZMZ堆肥微生态调节剂可以提高好氧性纤维素分解细菌、氨化细菌、氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌数量，可明显降低厌气性纤维素分解细菌和反硝化细菌数量。
目前应用的接种剂主要有微生物培养剂、商业添加剂和有效的自然材料3种。有效自然材料主要是指粪便堆肥、牛粪、马粪、耕层土壤和菜园土等，其中含有种类丰富的微生物群体。微生物分解垃圾中有机物的过程受一系列环境条件的制约［114］。
堆肥原料中的物质成分比较复杂，包括微生物比较容易分解利用的营养物质，如碳水化合物、蛋白质、脂肪和纤维素、半纤维素；不易为微生物分解的营养物质，如纤维素、木质素等，微生物代谢中能够利用的无机盐，微生物不能利用的无机盐、重金属、有机化合物和多聚化合物等毒性污染物，以及活性污染物，如病原体、虫卵、杂草种子等。表3-32列出了堆肥中微生物分解营养物质的主要情况。
从表3-32可知，堆肥中较难降解的物质是纤维素，最难降解的是木质素，因此纤维素、木质素的破坏意味着细胞物质的解体和腐殖质的产生，这是堆肥腐熟过程中的最重要的物理性状变化。为此，各种加速纤维素、木质素分解的技术（如人工接种高效纤维素分解菌）均具有积极意义［114，115］
表3-32 堆肥中微生物分解营养物质的主要情况
（1）纤维素分解菌剂
纤维素是植物残体中最丰富的部分，它是由β（1-4）糖苷键连接葡萄糖单元所组成的长链状大分子。通常一条链中含有10000多个葡萄糖分子，其葡萄糖亚基排列紧密有序，形成类似晶体的不透水的网状结构，以及分子间结合不甚紧密、排列不整齐的无定形区域。纤维素易与木质素等难分解的物质相复合，因此，纤维素不溶于水，难以水解，分解需要至少3组水解酶的协同作用，即纤维素内切酶（endo-cellulase）、端解酶（exo-cellulase）和纤维素二糖酶（cellobiase）。纤维素分解首先是纤维素的晶体消失，继而生成纤维二糖、戊二糖，最后经纤维二糖酶作用分解成便于吸收的葡萄糖。
多种微生物，如假单胞菌（Pseudomonas）、色杆菌（Chromobacterium）、芽孢杆菌（Bacillus）及多种真菌诸如木霉（Trichoderma）、毛壳素菌（Chaetomium）、青霉（Penicillium）等可利用纤维素酶分解纤维素。
国内彭家元和陈禹平从堆肥中分离筛选出好热性纤维素分解菌，扩大培养后制成菌剂，称为元菌剂，作为堆肥的接种剂应用。另外，前东北农科所推广的札札菌，是从厩肥、堆肥或马粪中分离出来的好热性纤维素分解芽孢杆菌。将这种札札菌加富培养制成菌剂，使用时用水稀释，将稀释液浇泼到堆肥各层中可以加速堆肥的腐熟。中国科学院成都生物研究所近年来就在分离筛选城市生活垃圾处理功能微生物方面进行了大量工作。中国科学院南京土壤所进行了“垃圾堆肥微生物接种实验”研究。他们从22个垃圾堆肥、畜粪、土样等样品中分离获得纤维素分解菌198株，选其中2株生长快、粗纤维分解能力强的菌株制成菌剂，以0.05%～0.1%的接种量加入二次发酵垃圾堆肥中，结果显示接种堆肥比不接种堆肥升温快、堆温高、高温维持时间长，真菌和纤维素分解菌数量增多，腐殖质含量提高21%～26%。肥效试验证明，施用堆肥比不施用堆肥可使青菜增产9.9%。近年来，四川省绿色环境保护产业发展有限公司分离筛选到一些高温纤维素分解微生物，将几种功能明确的微生物扩大培养后按一定的比例混合制成速效垃圾发酵菌剂，用于高温堆肥发酵，明显缩短了垃圾堆肥发酵腐熟时间。沈根祥等［116］研究了Hsp菌剂对牛粪堆肥发酵影响时发现，Hsp菌剂能迅速提高发酵温度，加快腐熟化进程，有效杀灭粪中所含的杂草种子和虫卵病菌，具有快速堆肥熟化和无害化的功效。蒲一涛等［117］研究了混合培养对固氮菌和纤维素分解菌生长及固氮的影响，结果表明：在混合培养条件下，两种菌能相互利用、相互促进，混合培养液的菌数增加，固氮菌的固氮能力提高，这两种菌可混合培养制成混合菌剂。研究人员经过CMC平板、滤纸液化和摇瓶培养实验，发现6株菌中产黄纤维单胞菌（Cellulomonas F1）和康氏木霉（Trichodermakonigii）2株菌分解纤维素类物质的能力比较强，但对来源不同的纤维素类物质分解能力差异很大；同时也证明真菌与细菌一起接种时分解纤维素类物质的速度明显高于其中任何一个单一菌株，说明纤维素类物质的分解需要多种微生物的联合作用。
（2）木质纤维素分解菌
木质素是目前公认的微生物难降解的芳香族化合物之一，木质素是由苯丙烷结构单元组成的复杂、近似球状的芳香族高聚体，由对羟基肉桂醇（p-hydroxycinnamylalcohols）脱氢聚合而成，分子大（分子量>1.0×105）、溶解性差，含有各种生物学稳定的复杂键型，没有任何规则的重复单元或易被水解的键（图3-50）。木质素的分解是一个微生物作用下的氧化过程，首先被胞外酶分解成小分子物质，然后这些小分子物质被植物细胞所吸收，部分转化成石炭酸和苯醌，然后和氧化酶一起排放到环境中。但是与其他成分如纤维素、半纤维素等降解物不同，微生物及其分解的胞外酶不易与之结合，同时木质素又对酶的水解作用呈抗性，使得其难以降解。
图3-50 木质素结构示意
放线菌在一定程度上可改变木质素的分子结构，继而分解溶解的木质素，它通常由许多细胞菌丝缠绕在一起，在高温阶段、降温阶段和熟化阶段出现，且数量相对较多，以至于在堆肥表面肉眼可见。在堆肥过程的后期，由于易利用和较易利用的有机物逐渐消耗，仅剩下木质素等极难分解的物质，微生物之间的竞争也日趋激烈，能在一定程度上分解木质素并产生抗生素的放线菌逐渐占优势。但由于土著放线菌难以大量降解木质素，使得成熟堆肥中腐殖质主要是由木质素、多聚糖和含氮化合物所形成的腐植酸，芳香结构和羟基较多，碳水化合物较少［118，119］。在不利的条件下，放线菌能形成孢子，较耐高温和各种酸碱度，所以在高温阶段放线菌对分解木质素、纤维素起着重要的作用。高温放线菌可以从自然界中许多地方分离出来，如砂子、成熟肥堆、马粪、果园土等。主要包括诺卡氏菌属（Nocardia）、链霉菌属（Streptomyces）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、小单孢菌属（Micromonospora）。
在堆肥过程中，真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要作用。在自然环境中高温真菌生长在庭院垃圾堆肥、鸟粪、木炭，植物残体、冷却管及排水管中，在许多农产品中及木片堆中和泥炭土中也有高温真菌存在［120］。高温真菌对纤维素、半纤维素、木质素有很强的分解作用，它们不仅能分泌胞外酶，而且其菌丝具有机械穿插作用，共同降解堆肥中难降解有机物，促进生物化学反应，它们在堆肥中的作用如表3-33所列。
表3-33 对堆肥中纤维素木质素有分解能力的真菌
真菌中的木腐菌对木质素的生物降解起着至关重要的作用，木腐菌主要分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌。褐腐真菌主要分解纤维素和半纤维素（都是糖的聚合物）［121］。软腐真菌在中温环境下对木质素有降解能力，它能降解硬木或软木，但其降解速度非常慢。在自然界中木质素的降解主要靠白腐菌，大多数白腐菌既可降解硬木又可降解软木，其对木质素的降解速度和效率与其他菌种相比具有明显的优越性，因此，对白腐菌的研究最为广泛。黄茜等［122］从6株常见的食用白腐菌中筛选出了生长优势较强、产漆酶酶活高的平菇HF，为了让秸秆得到更好的降解和利用，采用平菇和康氏木霉二步混合发酵法；通过不同的组合方式，发现H6-T10组合得出的降解效果最好，其木质素降解率达到44.77%，纤维素降解率达到41.48%。陈芙蓉［123］选取由农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、简青霉、栗褐链霉菌，通过正交试验以优化混合比例，开发出1种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂。该混合菌剂具有较强的木质素降解能力，其对木质素的降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果；当按照个数比细菌∶放线菌∶真菌为85∶5∶10、枯草芽孢杆菌∶铜绿假单胞菌为55∶25、黑曲霉∶简青霉为2∶1配比时，木质素、纤维素、半纤维素降解率最高，分别达到22.13%、48.97%和55.93%。
（3）其他堆肥菌剂
国外在多年的微生物学研究和应用过程中，一些高性能、分解能力强的降解菌被发现并已实现商业化生产。日本琉球大学比嘉照夫教授多年潜心研究开发的高效生物技术产品——EM有效微生物菌群，由10属80多种微生物如酵母菌、放线菌、乳酸菌、固氮菌、纤维素分解菌等经特殊方法培养而成，对提高堆肥效率、去除臭气等方面效果明显。日本微生物专家岛本觉也研究开发酵素菌应用于环保方面也取得了一定成果。酵素菌的主要作用原理：酵素菌是由细菌、酵母菌和放线菌等24种有益微生物组成的群体，它们能够产生活性很强的各种酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、氧化还原酶等几十种），具有很强的好氧性发酵能力，能够迅速催化分解各种有机物质，难溶性矿物质、纤维素等，使之在短时间内转化成为可供利用的成分，尤其能够分解含有毒素的有机物，使之变为无毒、无害物质。因此，堆肥过程中加入酵素菌，可加强分解难溶性矿物质、纤维素、木质素等的能力，提高这些物质的转化率和利用率，在短时间里分解转化成为可供植物利用的有效成分。
此外，奥卡尼克公司（http：//www.bedminster.se/index.html）开发的堆肥降解菌，含大量具有显著降解作用的被驯化的兼氧性微生物群。包括两种菌群：一种为嗜热性细菌群，在有足够氧气和湿度的前提下，能迅速开始新陈代谢并大量繁殖，从而快速进食有机物料，形成高效发酵效应，还配有特殊的除臭菌群，主要作用是锁住氨气、硫化氢等臭味气体；另一种为常温性细菌群，当高温过后温度逐渐降为常温后加入（加入量为100g/t垃圾）便可大量繁殖，将未被降解的有机物转化为腐殖质。该菌群在降解过程中也具有除臭功能，并会在细胞周围黏附一部分从挥发性气体来的氮、磷、钾等营养成分。
从目前我国复合微生物菌剂的研究状况可以看出，主要侧重于研究复合微生物菌剂的应用效果，对混合菌系中菌株间相互关系和作用机制的研究不够深入；虽然我国对复合微生物菌剂的构建也有了一些研究，但对复合培养的发酵过程及各菌群之间的相互作用和机理还不是很清楚，导致菌剂稳定性不强，群体结构易受环境影响从而导致菌剂的群体优势被改变。
3.6.1.3 微生物强化接种堆肥工艺
目前，国内外对于堆肥接种工艺的研究已经有了较大的进展，明显促进了初期堆肥化进程，同时保持较高的降解速度。席北斗等［124］在堆肥接种剂上进行了一系列研究，提出了三阶段控温接种法，利用自身产热和少许外源加热，使堆体温度4h内迅速上升到70℃以上，并维持8h，从而降低堆体中土著微生物的浓度，并起到软化堆料的作用；待温度冷却至35～45℃时，接种复合微生物菌剂，使其快速生长繁殖，并保持优势地位，从而达到快速分解垃圾中有机物的目的。试验研究表明，利用三阶控温段接种法，在堆肥的不同阶段接种高效微生物复合菌剂，不仅加快堆肥反应速率，而且可以有效控制H2S等臭气的产生，改善堆肥环境。
陈耀宁等［125］提出在堆肥的过程中两次添加不同功能的两种复合菌剂的接种堆肥工艺。其主旨是在堆肥开始时添加有利于堆料中易降解有机物降解的复合菌剂A，加速物料降解的同时还可以使堆体温度快速升高。是在堆体温度升至55～60℃后添加具有纤维素类降解功能的复合菌剂B，促进堆料中的纤维类物质的深度降解，提高堆肥的腐熟度。本方法的优点是工艺简单，效果显著，既能保留堆料中土著微生物的降解功能，又能高效发挥接种微生物的优势作用，既提高了堆肥的效率又改善了堆肥的质量。该法也存在一定的缺点，如菌剂相对单一，堆肥过程并未完全按堆肥微生物群落结构演替、物质转化规律进行等。
彭绪亚等［126］提出一种堆肥垃圾渗出液循环强化培养接种堆肥工艺，主要是利用垃圾渗滤液自身丰富的微生物资源，采用人工方法对其强化培养制成高温菌剂和纤维素分解菌剂，在堆肥初期接种高温菌剂，在降温期接种纤维素分解菌剂。该方法将堆肥土著微生物富集培养后重新接种堆肥，能很好地避免接种外源微生物菌剂所带来的菌剂适应能力差、接种菌剂与土著菌之间存在竞争等不利因素。
王一明等［127］提出梯次循环接种温控堆肥的工艺方法，在堆肥过程的三个不同阶段根据堆肥温度的变化分别接种三种不同的具有促腐降解作用的功能菌剂，且在每个阶段的堆制发酵过程中取出其中的一部分原料作为功能菌剂供下一轮堆肥接种使用。即在堆肥初期，将中低温促腐降解菌剂混入堆肥原料中进行堆制发酵；堆温上升到55～60℃、维持5d以上后，添加嗜高温促腐降解菌剂进行堆制发酵；进入堆肥降温阶段、堆温下降到30～40℃后，添加半纤维素、纤维素、木质素促腐降解菌剂进行堆制发酵。上述三个阶段，在每个阶段的堆制发酵过程中取出其中的一部分原料作为功能菌剂供下一轮堆肥接种使用。由于不需要每次发酵都接种新菌剂，明显降低了堆肥成本，且循环接种能有效克服外接微生物与土著微生物的拮抗问题，充分发挥了土著微生物的积极作用，达到事半功倍的效果。
3.6.1.4 堆肥中微生物的研究方法
微生物在堆肥过程中起着至关重要的作用，然而由于堆肥物料及过程非常复杂，堆料中含有大量的腐殖质等大量干扰研究的物质，给堆肥微生物的研究带来了相当大的困难。随着生命科学技术的不断发展，研究手段的不断进步，也使得人们对堆肥微生物的认识逐渐深入。
堆肥微生物的研究方法主要包括传统的培养法和借助于分子、生化手段的非培养法两大类。传统的培养方法大多选用相应的限制性培养基进行分离纯化和培养选育，再结合菌落形态和生理生化特性来进行分析，从而对其中的微生物群落及其多样性进行研究，是目前研究者研究堆肥微生物学的主要方法。咸芳［128］从厨余垃圾堆肥过程中采用特定的培养基将厨余垃圾中的土著微生物进行分离，获得43株优势菌株，通过对其生理生化性质进行鉴定后通过正交分析构建成复合微生物菌剂，并经过堆肥试验验证该复合菌剂对厨余垃圾具有较好的降解活性。虽然，目前已经有很多研究者从堆肥中分离到了一些能对堆肥产生积极作用的微生物物种［129，130］或者添加某些菌种对堆肥工艺进行了某些改善［104］，但是对于复杂的堆肥系统中众多的微生物种群各自所发挥的作用我们目前仍然不明了，对堆肥的微生物学机理研究还很不透彻。随着人们对堆肥微生物的原位生存状态研究发现，借助于传统的培养方法只能分离到环境微生物总量的0.1%～1%［131］，严重地限制了人们对堆肥微生物真实性和全面性的认识；此外，用传统的方法从堆肥中分离和计数微生物不能得到堆肥微生物在堆肥体系中的原位生活特征和生态功能的信息［132］。由于传统的平板培养方法的局限性，不能充分反映堆肥微生物生态信息和生态功能，以致大量的在堆肥过程中发挥重要作用的微生物无法被人们所认识和发现，严重地限制了堆肥微生物学机理的深入研究。而近年来迅速发展起来的分子生态学方法则为人们对环境微生物的研究提供了一把钥匙。
Torsvik首先从土壤中提取DNA，并发现1g土壤中有约4000个以上不同的细菌种类，说明土壤微生物的种类非常丰富［133，134］。自此，基于DNA基础的环境微生物的研究方法也迅速发展起来，其中包括现已发展和应用成熟的限制片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）［135］、末端限制片段长度多态性分析（terminal restricton fragment length polymorphism，T-RFLP）［136］、随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）［137］、单链构象多态性分析（single-stranded conformational polymorphisms，SSC）［138］、克隆文库技术（clone libraries）［139］、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）［140］以及基于磷脂基础之上的磷脂脂肪酸分析（phospholipid fatty acid，PLFA）［141，142］等，这些技术都在实际的研究应用中发挥了重要作用。其中，基于16SrDNA/18SrDNA的变性梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）由于其独特的原理和优点目前已经被广泛应用到固体废物、水体和土壤的研究中去［143～146］。
3.6.1.5 堆肥微生物群落演替规律研究方法
堆肥是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现固体废物资源化、无害化的动态过程，对堆肥过程中的微生物群落结构变化规律进行有效的研究是了解堆肥作用机理的必要前提，传统的研究方法主要采用以细菌、放线菌和真菌的分类培养方法研究堆肥过程中的微生物群落的动态变化，或者按照G+菌、G-菌、嗜温菌、氨化细菌、硝化细菌等方法进行研究。
随着人们对堆肥微生物机理探索脚步的不断前进，传统的微生物培养方法已经不能够准确揭示堆肥的微生物学奥秘，而随着研究手段的不断改进，目前国内外研究者试图应用各种有效手段来对堆肥过程中的微生物群落结构变化规律进行研究，Bonito等［147］利用克隆文库技术（clone library）分析城市有机垃圾堆肥中的真菌群落变化，研究发现在堆肥的起始阶段（29.4℃）检测到了大量的酵母菌序列，包括人类病原菌、热带念珠菌和克鲁斯氏念珠菌。高温期后期（55℃）电泳结果中有1/2的基因序列是担子菌纲，不仅有能产生子实体的担子菌纲还有大量不产子实体的担子菌纲。堆肥末期（51.7℃）的真菌克隆中绝大多数都是红色链霉菌属。研究中没有发现接合菌亚纲和曲霉属。Bonito等的这些研究结果将引导我们对关于堆肥微生物的种类的一直持有的观点进行重新评价。
杨恋［148］研究城市生活垃圾好氧堆肥过程中嗜热微生物群落结构变化规律，结果发现：细菌总数、真菌总数和放线菌总数分别呈“升高-降低”“降低-升高”和“升高-降低-升高”的趋势，这与高温期有机质降解率呈“下降-上升-下降-上升”的变化规律有着密切的关系。DGGE分析结果显示：高温期嗜热细菌较真菌、放线菌种类要多，但优势菌种没有真菌明显；嗜热真菌优势菌明显，但整体菌群种类不多；嗜热放线菌优势菌不及同时期嗜热真菌明显，但菌群种类比嗜热细菌少、比嗜热真菌多。
喻曼等［149］在稻草固态发酵体系中同时接种土壤微生物和黄孢原毛平革菌，用磷脂脂肪酸（PLFA）谱图分析法研究发酵过程的微生物群落和生物量变化，同时监测木质纤维素降解率的变化。结果表明，发酵后木质纤维素的降解率可达44%。根据标记性脂肪酸的变化，在发酵第6天，革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌的含量都达到了最高值，其中，革兰阳性菌的含量较低；真菌和细菌的脂肪酸含量比值变化范围为0.2～0.5，说明真菌是降解木质纤维素的主要群落。主成分分析结果显示，发酵后期以18碳不饱和脂肪酸为主，与标记性脂肪酸分析结果一致，同时跟木质纤维素降解率的变化趋势对应，因此PLFA分析法可以较好地反映稻草固态发酵过程中的微生物群落结构和生物量的变化。
王芳［150］运用PCR-DGGE技术快速、准确地显示了堆肥过程中细菌群落的动态变化，细菌种群数量的变化随着堆肥温度的变化表现出“升高—降低—升高”的规律。接种菌剂改变了堆肥微生物的菌落变化，增加了优势菌群的数量和堆肥腐熟期微生物群落的多样性。
郁红艳［151］利用Biolog法分析细菌功能群落变化与木质纤维素的降解关系，研究发现：细菌群落在农业废物堆肥化进程中对有机物的转化起着重要作用。堆肥初期细菌生长快速、群落丰富，随着堆制的进行，其平均活性逐渐下降。细菌群落结构在一次发酵期间发生着剧烈变化，二次发酵期间趋于稳定。能转化Biolog GN2板上第一、二类碳源的细菌是农业废物堆肥化进程中的主要细菌种群，且与木质纤维素的转化有关系。第四、六类碳源可表征堆肥化中耐受高温的细菌，其中第四类碳源转化细菌与木质纤维素的降解有关，而第六类碳源转化细菌属于易降解有机物转化细菌。