1.3.1 降解石油烃产甲烷的功能菌群
在油藏内部已经分离得到了多种不同功能的厌氧微生物，主要包括发酵菌、产甲烷古菌[52，53]、 三价铁还原菌[54]、硫酸盐还原菌[55]、硝酸盐还原菌。而后人的大量实验也证实了厌氧代谢的电子受体一般包括（三价铁、锰离子、二氧化碳、硫酸盐等）[56～60]。但是最初因为高温高压以及高地层水矿化度的厌氧环境使得微生物的生存环境异常苛刻，所以人们认为在这种环境中微生物很难生长，而在此期间，Bastin等在油藏内部分离得到了厌氧菌群[61]，改变了人们的想法，此后各种不同功能的厌氧微生物菌群被发现和分离，而且不同种类的电子受体也被大量发现。近年来，人们越来越认识到油藏内部的产甲烷过程是多种菌群共同作用的结果[9]，有研究表明：整个过程主要涉及的反应有4种类型，a.在各种还原菌群的共同作用下石油烃失去电子发生氧化反应；b.乙酸失去电子发生氧化反应；c.乙酸分解生成甲烷；d.二氧化碳接受电子还原产生甲烷[24]。例如，长链烷烃通过复合菌群的共同作用产生乙酸和二氧化碳以及氢气，最终在产甲烷古菌和其他硫酸盐和硝酸盐还原菌的作用下产生甲烷和其他气体[3，20]。下面我们来介绍一下石油油藏中的主要菌群。
（1）发酵菌（Fermentative bacteria）
石油油藏中的烃类通过发酵菌的作用产生氢气、二氧化碳和有机酸类，它们分为细菌和古菌两类[62]。油藏的高温环境中含有耐高温的发酵菌，其中，一些发酵菌还是非常古老的菌种，发酵产物为气体和有机酸类[63，64]。另外，有学者研究证实了发酵菌主要产生乙酸、丙酸、氢气和二氧化碳。而且还有极其稀少的远古细菌会发酵有机物产生氨基酸，这也向我们暗示其重要的地位[65，66]。
（2）硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria）
硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria，简称SRB）能还原多种硫酸盐类，同时以这些硫酸盐类作为电子受体，最终将这些硫酸盐类还原成硫化氢。已知硫酸盐还原菌存在于大部分的油藏中。硫酸盐还原菌是一个复杂的生理菌群，在其众多性质中最重要的是活力、最适温度、厌氧氧化能力等。该还原菌又可分为革兰氏阴性嗜温菌、革兰氏阳性芽孢菌、嗜热细菌、嗜热古细菌四大菌群，它们都以硫酸盐作为电子受体进行无氧呼吸[67]。还有学者研究革兰氏阴性嗜温菌的演化历史（图1-4），从中得出一些关于细菌演变的线索，硫酸盐还原菌的共同祖先是一些光养生物，随后在漫长的演变过程中一些菌群失去了光合能力变成异氧细菌[68]。通过研究得知：Desulfovibrionaceae 和Desulfobacteriaceae 已经出现很大分化，Desulfobacteriaceae是原始的细菌，因为它包括一个δ-Proteobacteria，而Desulfovibrionaceae却没有这部分[69，70]。
图1-4 Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae菌群家族嗜温菌的系统发育树演变分析[69，70]
（图中的数字代表百分数，说明亲缘关系远近，数字越大关系越近，低于50%的没有说明）
其他研究人员也发现硫酸盐还原菌可以在富含石油烃的环境中正常生长，如在烷烃、苯及苯系物的环境中，并从这些环境中分离纯化了多种硫酸盐还原菌[71]。另外有研究表明：分离自海洋沉积物的硫酸盐还原菌株Tol2可以降解甲苯，且有两种脱氢酶参与了降解反应[72]。还有学者从被石油污染的土壤中分离得到了prtol1菌株，其为1株硫酸盐还原菌，以甲苯为唯一电子供体和碳源，降解甲苯为二氧化碳，降解过程中有15%的甲苯转变为非挥发代谢物[73]。还有研究团队从烷基苯培养试验中分离得到2株培养菌oXyS1和mXyS1，以硫酸盐为电子受体，分别能降解邻二甲苯和间二甲苯，并且都有降解苯甲酸和苯甲酸甲酯的能力，而且通过16S rRNA序列分析发现：oXyS1与已知菌株Desulfobacterium cetonicum 和Desulfosarcina variabilis的相似值分别达到98.4%和98.7%，而mXyS1与Desulfococcus multivorans 的相似值为86.9%[74]。
有学者从严格厌氧降解实验中分离得到硫酸盐还原菌，其能够降解甲苯、邻二甲苯、间二甲苯，进一步研究表明：在其细胞提取液中发现了苄基琥珀酸和甲基富马酸[75，76]。另外，有团队从一个油藏中发现了1株硫酸盐还原菌能够降解甲苯，为革兰氏阴性，最宜温度34～38℃，最佳盐度为1.5%（体积比百分数），适宜pH值为7.2～7.5，细胞形态呈杆状[77]。还有学者从含十六烷的富集培养基中分离到1株厌氧菌，它能利用硫酸盐作为电子受体并将它还原为硫化氢，而且在脱氢酶的作用下这株菌可以降解C12～C20的长链烷烃[55]。
有学者则从萘存在的富含硫酸盐的海洋沉积物中富集培养硫酸盐还原菌，该菌株以萘为唯一碳源和电子供体，最终硫酸盐被还原成硫化物[78]。另外，有学者从海洋沉积物中分离得到2株菌，是严格的以硫酸盐为电子受体的厌氧菌，对C12～C20有明显的降解作用，通过16S rRNA序列分析，2株菌高度同源[79]。还有学者从被石油污染的河口沉积物中，分离得到降解烷烃的硫酸盐还原菌，此菌株为革兰氏阴性杆菌，可以降解C13～C18链的正构烷烃，而且以脂肪酸、甲酸盐为电子供体，硫酸盐、亚硫酸盐为电子受体[80]，进一步通过气相色谱-质谱检测表明：该正构烷烃代谢产生琥珀酸[81]。而其他学者通过研究含油废水和油田生产水，从中分离得到1株新的菌株，为Desulfoglaeba alkanexedens属的新种，其能够降解C6～C12的烷烃，为革兰氏阴性短杆菌，并且常成对出现，最适宜生长温度37℃，适宜pH值为7.2[82]。通常乙烷、丙烷和丁烷等短链烃类化合物是天然气的成分，有学者从海洋天然气渗漏区提取物中富集到能够降解短链烃的硫酸盐还原细菌[83]。近年来，有学者通过PCR-DGGE分析技术确定了高效烷烃降解菌，它同样是以硫酸盐为电子受体，实验中其能对C6与C10的烷烃进行降解[84]。另外，本书中详细列出了各研究报告中的硫酸盐还原菌及其可利用的底物（表1-1），而且也列出了几种有代表性的硫酸盐还原菌的重要性质（表1-2）。
表1-1 厌氧降解烃的硫酸盐还原菌[85，86]
注：数字表示碳的数量。
表1-2 典型硫酸盐还原菌的重要性质[67]
（3）硝酸盐还原菌（Nitrate-reducing bacteria，简称NRB）
硝酸盐还原菌可以还原硝酸盐为氨，有学者从废水中提取一株细菌，初步鉴定为假单胞菌属，其经过纯化培养后能够降解甲苯，并且以硝酸盐作为降解的电子受体。此外，该菌株也能够降解间二甲苯、苯甲酸、苯甲醛[92]。在厌氧条件下，有学者用甲苯作为唯一碳源，分离出能够降解甲苯的菌株，其中大于50%的甲苯碳被降解为二氧化碳，29%的碳被吸收，甲苯的降解速率为1.8mmol/（min·L），而且它有不同于其他细菌降解甲苯的途径[93]。
另外，也有学者从含有各种芳香族化合物的培养基中分离出几种假单胞菌属，以硝酸盐为电子受体，其中有7株是能够降解甲苯的菌株，而且研究表明：超过50%的甲苯变为二氧化碳，而且厌氧降解甲苯是通过甲基侧链羧化为苯甲酸实现的，而且高达37%的碳被吸收进微生物细胞质。但是其对甲酚、羟基苯甲醇、苯甲醛或对羟基苯甲酸的降解缓慢或有不同的滞后时间[94]。
一般反硝化也称脱氮作用，反硝化细菌在缺氧条件下还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理菌群称为反硝化细菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源进行无氧呼吸。有学者通过16S rRNA序列分析，共分离得到8种降解甲苯的反硝化菌株，然后构建系统进化树，利用距离矩阵、最大简约法和最大似然方法确定各个菌种的种属关系，表明这8种反硝化菌株形成一个密切相关的集群[95]。而其他学者也在研究世界不同地区的污染土壤和农业土壤，并且从中富集了能够降解甲苯的菌群，在相对较低的甲苯浓度下（通常为5mg/L）分离得到了10株细菌，通过PCR指纹分析表明：有多个不同种属的菌株，并且其对芳香族化合物都有较强的降解能力，所有菌株都是革兰氏阴性杆菌，其中4株有固氮酶结构基因，所有菌株都有血红素亚硝酸盐还原酶。进一步通过16S rRNA分析表明：这些菌株是彼此密切相关的，它们属于Azoarcus属[96]。
有学者对淡水泥浆样品进行了厌氧降解，从中提取出2个新的反硝化菌株EbN1和pbn1，在硝酸盐存在下，该菌株可以降解烷基苯和侧链长于甲苯的芳烃类，能降解乙苯和丙苯；同时在含有甲苯和间二甲苯的泥浆中分离到两个反硝化菌ton1和mxyn1，16S rRNA序列分析揭示该菌株与Thauera selenatis有密切的关系[97，98]。 而其他学者通过反硝化细菌对乙苯的厌氧降解反应，提取到了EB1，在反硝化条件下EB1降解乙苯，而且有学者发现菌株EB1细胞代谢乙苯后，形成1-苯基乙醇、苯乙酮和一个未知的化合物，同时在光谱数据分析的基础上确定了未知的化合物是苯甲酰乙酸乙酯，并且实验使用H218O标记表明：其厌氧降解乙苯的第一个产物为羟基1-苯基乙醇，其羟基来源于水[99]。另有学者在生物治理柴油污染的含水层时，通过原位NO
的注入和营养物的添加，以刺激微生物活性，经过3.5年的整治，从含水层样品中分离得到的细菌菌株能够对特定的烃类化合物进行厌氧反硝化降解，与此同时为了更好地模拟反硝化的修复过程，在实验室中构建了一个模拟含水层，也取得了成功[100]。另外，有学者用三氯乙烯（TCE）驯化分离得到的菌株，发现其能够以共代谢的方式降解苯酚或甲苯，对这些降解菌进行测量表明：该菌株对这些基质相当敏感，而对它们的基因序列鉴定，发现其中60%为苯酚和甲苯降解菌株，并且在实验中应用了甲苯邻单加氧酶探针进行杂交分析，以探讨可能的降解途径[101]。
在厌氧条件下，有研究者也分离得到了一株硝酸盐还原菌，其能够降解烷基苯和二甲苯的三种异构体，对异丙基甲苯降解的速度最快（4周内），对天然芳香烃降解时间为6周，而对其他烷基苯的降解效果不明显，而实验还表明其厌氧降解烷基苯至少有两个酶系统，一个代谢芳香族和乙基甲苯，其他代谢甲苯[102]。而苯污染也是一个严重的问题，尤其是在地下水和地表水中，同时它也是难生物降解的有机物，但是有研究表明：在厌氧降解苯的实验中，硝酸盐和三价铁、硫酸根、二氧化碳可以用作电子受体，而且有学者富集了Dechloromonas菌株，可以完全代谢各种单芳香族化合物包括苯，并且用CO2可以作为替代硝酸盐的电子受体，说明这些微生物可适用于环境污染的防治[103]。另外，本书也比较详细地列出了各研究报道中的硝酸盐还原菌及其可利用的底物（表1-3）。
表1-3 厌氧降解烃的硝酸盐还原菌
（4）铁还原菌（Iron- reducing bacteria）
有学者分离到可以降解甲苯和苯酚的厌氧细菌，它们都是以三价铁作为电子受体，最后生成二价铁和二氧化碳[54]。又有学者从受石油污染的水层中也分离得到了类似的严格厌氧菌株，为革兰氏阴性菌，分别属于3个种属，并且都能够降解芳香族化合物[104，105]。综合国内外多位学者的研究情况，铁还原菌降解烷烃的种类不一样，分离的方法也多种多样，而且铁化合物广泛存在于油藏里，主要有两种价态，分别是三价铁和二价铁，在烷烃降解反应时其可以作为电子受体，而且铁还原菌也是多种多样的，有嗜温和啫热厌氧菌，并且铁还原菌也可以以硝酸根、锰离子作为电子受体，也有以氢气作为电子供体，乙酸为碳源[106～109]。
（5）产甲烷古菌（Methanogenic archaea）
产甲烷古菌广泛存在于土壤、底泥、地热环境、油井、海底沉积物中[118]，同时厌氧产甲烷古菌处在有机物降解产甲烷的最后环节，通过利用小分子物质产甲烷，而甲烷气体有着广泛的应用[119，120]。产甲烷古菌有3种营养类型，分别是氢营养型、甲基营养型、乙酸营养型，在产甲烷途径中，通过与其他菌群的协同作用将长链有机物降解成短链的无机物或有机物，然后通过产甲烷古菌降解产生甲烷[121，122]。
产甲烷古菌的主要类型如下。
① 氢营养型主要有伊万诺夫甲烷杆菌[123]、热自养甲烷杆菌[124]、布氏甲烷杆菌和嗜热嗜碱甲烷杆菌[125]、热自养甲烷球菌[126]、石油甲烷盘菌属[127]、耐盐甲烷卵圆形菌[128]。
② 甲基营养型有盐水甲烷嗜盐菌[129，130]、斯氏甲烷八叠球菌[131，132]。
③ 乙酸营养型有马氏八叠球菌[133]。
本书进一步总结了产甲烷古菌的分类情况，表1-4可以看出甲烷菌的细致分类情况。还有学者认为当硫酸盐和硝酸盐这些电子受体缺乏时，烷烃仍然可以被富集培养的菌群降解，生成二氧化碳和甲烷，另外Julia Foght认为厌氧降解芳烃可以通过氯酸盐、高氯酸盐或锰离子作为电子受体。
表1-4 产甲烷古菌系统分类及其代谢底物[41]
