第3章 高效产甲烷菌群的建立
数百万年来油藏内部进行着原油厌氧降解产甲烷过程，而随着油藏的开采大量残余原油留存地下，通过微生物作用使残余原油（石油烃）降解产甲烷已成为油藏深度开发利用的新方法。油藏微生物由诸多菌群组成，这些菌群协同作用实现石油烃的降解，石油烃降解过程中涉及的反应步骤多、反应速率影响因素多，代谢方式也是多种多样，而残余原油中可以供微生物利用的营养物质和厌氧产生的毒害物质的数量是影响降解效率的关键因素。目前，研究者多通过外加碳源、氮源、磷源、微量元素、维生素、络合剂等来激活微生物，从而提高石油烃的降解效率。石油烃降解的终端产物是甲烷，而电子受体（硝酸盐、四价锰、三价铁、硫酸盐等）的耗尽是甲烷产生的基础。产甲烷古菌会和其他菌群形成互营共生关系，最终使石油烃降解并接受末端电子产生甲烷。为进一步提高石油烃的降解效率，笔者总结了降解石油烃的厌氧微生物菌群及其代谢特性，并对微生物厌氧降解石油烃产甲烷的代谢途径进行了比较。
油藏中的微生物划分为好多种，其中根据微生物自身的特殊性质可将它们划分为若干个种群，大致包括烃氧化菌、发酵菌、硝酸盐还原菌、铁还原菌、硫酸盐还原菌和产甲烷古菌[1～4]。大部分在油藏中生长的微生物可以产生一些气体代谢物，这些气体代谢物包括CO2、H2、N2、CH4、H2S，而这些微生物的代谢需要一些电子受体的参与，其中常见的电子受体为氧气、硝酸盐、硫酸盐、三价铁、有机酸等[5～8]。对老油田进行的深度开发，提高原油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。现有的提高采收率技术存在的主要问题是提高幅度有限，大量的残余油滞留地下。烷烃厌氧生物降解产甲烷过程是多种菌参与、多步骤的反应，整个降解过程反应速率的影响因素非常多[9～13]。有学者研究认为影响原油的厌氧生物降解的主要因素之一就是烃的化学性质，特别是溶解性[14]。加快原油厌氧降解速度的可行方法之一就是增加微生物对石油烃的摄取能力，而微生物大多生活在水相中[15，16]。地层残余油厌氧生物降解的其他影响因素还有微生物的活性和丰富度[17]，在整个厌氧降解过程中，相关的功能菌群扮演着重要角色，这些功能微生物的丰度和活性影响整个降解速率，因此可以通过添加营养物质来激活功能菌群增加它们的丰富度，从而加快原油厌氧生物降解的速度[1，3，15，16]。此外， 解除中间产物的抑制，使反应朝着有利的方向进行也是提高烃厌氧降解速率的关键因素。对原地微生物和它们营养需求，原油、地层水和岩石基质的物理、化学组成有一定了解后，就可以确定促进和维持微生物群活性的总体生态环境， 刺激微生物可以通过调整地下环境来进行，改变环境条件包括改变地层温度、pH值、Eh值和盐度及二氧化碳、游离氧和氢含量等，环境的改变可以通过人为的因素，从而加快微生物产气效率[1，3，13，16]。
地下油藏是一个复杂的环境，现在人们的研究主要集中在常温常压下，而要想提高石油的利用效率，必须得进行模拟地层条件下的石油烷烃降解研究，这在以后的实际利用中将有重要意义。总之， 微生物在地层中就地产气， 是微生物提高石油采收率的一个非常重要的因素。随着世界人口的增长，人们对化石能源的需求日益增加以及全球石油资源的减少使人们重新认识到石油产甲烷的重要作用，特别是一些废弃油藏中的残余原油没有被更好地利用，而这一现象可以作为一种微生物强化石油开采技术得到大范围利用[18～20]。微生物可以在油藏中代谢产生气体、生物表面活性物质、有机酸[20]等，绝大多数微生物在代谢过程中都会产生气体， 通过增大油藏压力、降低原油黏度改善流度比， 提高原油的流动能力。对于能源利用效率的提高，微生物的作用日益得到人们的重视，因为这种微生物强化石油开采技术不需要大规模的能源投入，所以其被看作是一种先进的绿色能源利用战略，在微生物强化石油开采技术中，营养物质和外源微生物的注入可以达到提高石油利用率的预期效果，而且微生物能利用一些廉价的可再生资源生产大量副产品[20]，这些副产品的产生可以增加石油的利用率，包括生物表面活性剂、乳化剂、羧酸类、醇类和气体。因此，本实验在模拟油藏压力和温度下进行，考察外援添加物的注入对残余油气化产甲烷的影响。
由于高温高压以及高地层水矿化度的厌氧环境使得微生物的生存环境异常苛刻，就在人们认为在这种环境下微生物很难生长时，此后，不同功能的厌氧微生物菌群被发现和分离[3]。而多种的厌氧降解电子受体（硝酸盐、硫酸盐、三价铁、二氧化碳、锰离子等）也被大量发现[7～12]。近年来，人们越来越认识到油藏内部的产甲烷过程是多种菌群共同作用的结果，这其中涉及的菌群有发酵菌、硫酸盐/硝酸盐还原菌、厌氧产甲烷菌等[13]，整个过程主要涉及的反应有四种类型：第一，在各种还原菌群的共同作用下石油烃失去电子发生氧化反应；第二，乙酸失去电子发生氧化反应；第三，乙酸分解反应产生甲烷；第四，二氧化碳接受电子还原产生甲烷。其中，二氧化碳接受电子还原为生成甲烷的主要方式[14]，长链烷烃通过复合菌群的共同作用产生乙酸和二氧化碳以及氢气，最终在产甲烷古菌和其他硫酸盐和硝酸盐还原菌的共同作用下产生甲烷和其他气体[15，16]。前人已经研究的硫酸盐还原菌，已知硫酸盐还原菌存在于大部分的油藏中。硫酸盐还原菌是一个复杂的生理菌群，在其众多性质中最重要的是活力、最适温度、氧化能力等，而根据rRNA序列分析又可分为革兰氏阴性嗜温菌、革兰氏阳性芽孢菌、嗜热细菌、嗜热古细菌硫酸盐还原菌四大菌群，它们都以硫酸盐作为电子受体进行无氧呼吸[17]。还有学者研究革兰氏阴性嗜温菌的演化历史，从中得出一些关于细菌演变历史的线索，硫酸盐还原菌的共同祖先是一些光养生物，随后在漫长的演变过程中，一些失去了光合能力变成异氧细菌[18]。通过研究得知 Desulfovibrionaceae 和Desulfobacteriaceae 已经出现很大分化，Desulfobacteriaceae是原始的细菌，因为它包括一个δ-Proteobacteria，而Desulfovibrionaceae却没有这部分[19，20]。
由于产甲烷古菌在天然气形成方面的巨大作用，使得其受到了世界范围类的广泛研究，而几年来油藏残余油降解产甲烷成为一个新热点，人们通过研究产甲烷古菌来揭示和利用这一过程。产甲烷古菌和其他复合菌可以通过厌氧发酵过程将有机物降解生成甲烷气体，这期间伴随着其他降解产物的生成，如氢气和二氧化碳，产甲烷古菌广泛存在于土壤、底泥、地热环境、油井、海底沉积物中[21]。同时，厌氧产甲烷古菌处在有机物降解产甲烷的最后环节，通过利用小分子物质产甲烷，而甲烷气体有着广泛的作用，而且还是一种温室气体[22，23]。产甲烷古菌有3种营养类型，分别是氢营养型、甲基营养型、乙酸营养型，在可能的途径中通过其他菌群的协同作用将长链有机物降解成短链的无机物或有机物，然后产甲烷菌在降解产生甲烷[24，25]。
① 氢营养型 主要有伊万诺夫甲烷杆菌[26]、热自养甲烷杆菌[27]、布氏甲烷杆菌和嗜热嗜碱甲烷杆菌[28]、热自养甲烷球菌[29]、石油甲烷盘菌属[30]、耐盐甲烷卵圆形菌[31]。
② 甲基营养型 盐水甲烷嗜盐菌[32，33]、斯氏甲烷八叠球菌[34，35]。
③ 乙酸营养型 马氏八叠球菌[36，37]。
当硫酸盐和硝酸盐这些电子受体缺乏时，有实验表明烷烃仍然可以通过富集培养的菌群厌氧降解，生成二氧化碳和甲烷。
俄克拉荷马大学Suflita教授在油藏现场的研究工作，其研究结果表明：将油藏的油和微生物菌群在一起培养时，由于微生物作用，在第297天时甲烷产生量达到最大值[1]。学者利用实验证明了石油烃的厌氧降解[29]。而Lovley等分离得到了高效降解甲苯的菌GS-15株，它们是被分离得到的第一株以三价铁为电子受体的菌株[30]。有学者首次分离到以硫酸盐为电子受体的还原菌Hxd3，它们能够利用长链饱和烃[31]。
有研究表明：甲烷正是油藏中石油烃降解的终端产物之一，产甲烷古菌需要与其他细菌形成一种特殊的互营关系，持续降解石油烃并接受末端电子产生甲烷，而处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌在微生物采油方面、生物修复以及生物圈碳元素循环中起着重要的作用。而且最近有很多学者已经证实了这一现象，他们通过加入更有潜力的石油降解产甲烷菌群来降解石油烷烃，而且取得了很好的效果[38，39]。
本章经过长期的实验，设计了油藏模拟装置，在温度为55℃和初始压力为10MPa的油藏条件下模拟残余油气化产甲烷。有文献报道通过模拟生物降解石油，并且进行油气地球化学测定而且用不同的仪器设备进行数据分析，得出温度对微生物的生长起着重要作用， 当油藏温度超过80℃时，微生物就很难生存，而油藏温度小于等于40℃时微生物的生长量最大[22] 。然而在其他学者的研究中温度对产甲烷菌生长的影响不尽相同，Siddique[23]的书中认为产甲烷菌被发现在世界的任何角落，而且从5℃到110℃均有发现，它们可以降解有机物质并在碳循环中起着重要的作用。而且还有学者研究了北海石油的生物降解活动，结果显示温度与产甲烷菌的活性之间有重要联系，而且在70℃的条件下产甲烷菌的活性最高，充分说明可以利用原油中的土著微生物进行残余油的降解产甲烷，前人的实验多集中在模拟温度上，而油藏中还有一个重要的影响因素——压力，因此本章模拟了初始压力为10MPa下土著微生物的降解石油产气实验。
还有学者研究认为可以通过添加营养素来刺激产甲烷菌的生长[24]。目前残余油生物气化仍处于实验室试验阶段，有很多学者提出通过从油藏或河底淤泥中培养富集石油烃降解产甲烷菌种，然后接种到石油烃中，模拟降解产甲烷，这其中包括加入一些化学添加剂及营养物质或电子受体以增加甲烷的产量。还有学者通过从其他环境中富集的微生物进行降解产气实验，包括从油砂或油页岩中，改变环境条件，如添加对微生物有益的碳源、氮源等[1，3，16，24～26]。通过研究前人做的实验，尤其是添加外源物质来加快微生物降解原油，本章通过注入氮气和有机气体的混合物的处理（WYO2），与只通入氮气的处理（MYO2）进行对比，同时以灭菌处理（O1）作为对照，得出WYO2处理的最终甲烷含量明显高于MYO2，可能由于有机气体的加入促进了微生物降解石油烃，从而产生更多的甲烷气体。随着有机气体的注入，乙烯、异戊烷、正戊烷、顺式-2-丁烯等有机气体溶解在了石油中，这可能改变了石油烃的性质，从而有利于微生物对石油烃的降解产气；同时有机气体的含量也发生了变化，降解前后大部分有机气体减少，甲烷含量增加，差异显著。有利于有机气体的净化，同时更好地利用有机气体减小污染的排放，石油烃降解前后有明显的变化，原油中异戊二烯化合物姥鲛烷（Pr）和植烷（Ph）结构比较稳定，常以正十七烷/姥鲛烷（nC17/Pr）、正十八烷/植烷（nC18/Ph）的比值来确定石油烃的降解情况[27]，降解前后比值明显减小，表明WYO2处理的石油烃被充分地降解了。
当油藏环境中的硝酸盐、四价锰、三价铁、硫酸盐等电子受体耗尽，是甲烷产生的基础，而甲烷正是油藏中石油烃降解的终端产物之一，产甲烷古菌需要与其他细菌形成一种特殊的互营关系，持续降解石油烃并接受末端电子产生甲烷，而处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌在微生物采油方面、生物修复以及生物圈碳元素循环中起着重要的作用[12，28]。最近有很多学者已经证实了这一现象，他们通过加入更有潜力的石油降解产甲烷菌来降解石油烷烃，而且取得了很好的效果[1，2，3，16]。而来自地质学的证据表明，数千年来在地球内部油藏自发地进行这一产甲烷进程，因为地球内部很好地提供了这一厌氧产甲烷的条件[3，11，12，28]。随着世界人口的增长，人们对化石能源的需求日益增加以及全球石油资源的减少使人们重新认识到石油产甲烷的重要作用，特别是一些废弃油藏中的残余原油没有被更好地利用，而这一现象可以作为一种微生物强化石油开采技术得到大范围利用[3，10，16，29]。2004年年底俄克拉荷马日报报道了俄克拉荷马大学Suflita教授的研究工作，即通过微生物的作用，将油藏中残余油转化为天然气，可使老油田起死回生[1，29]。在美国有公司专门从事生物气的研究，这就是科罗拉多州的LUCA公司。开展将煤或油转化为天然气的研究，其中对Monument Butte油田研究结果表明，该油藏的油和水样在一起培养时，由于微生物作用，在最开始的60d内有相当大量的甲烷产生，而后在297d时甲烷产生量达到最大值，这与一般的微生物培养生长曲线相似。本书在前人研究的基础上，建立模拟反应装置，并且通入有机气体，研究有机气体对油藏中残余油甲烷气化的影响。
所以为了研究油藏中厌氧微生物的作用，争取筛选到更有潜力的产甲烷菌群，通过上一章的初步筛选分析后，本章对YH5和TH2菌群进行混合复配，而且设计了温度和压力模拟装置，考察温度和压力对复配后微生物厌氧降解石油烃产甲烷的影响，并且运用色谱-质谱技术分析复配后微生物降解石油烃产甲烷的效果，为以后老油井的气化开采或封存奠定基础。