2.2.2　实验方法

（1）含油污泥和采出液的石油烃含量测定

本实验取油田采出液时，取的是清液，为防止清液里边有石油烃，我们取了200mL采出液，用重量法进行测定石油烃含量，通过索氏提取器，在75℃时用氯仿回流萃取，时间为6h；然后回收氯仿混合液，转移到分液漏斗中，用8%的NaOH洗涤索氏提取器2～3次，都转入分液漏斗中，振荡2min，其次将上层碱液丢弃，剩下的氯仿溶液用蒸馏水洗涤3次，弃去上层水相；再次用无水硫酸钠脱水，转入蒸馏瓶中，常温除去氯仿；48h后称重，瓶子增加的重量即为石油烃含量。

注意：为防止轻组分石油烃挥发，对蒸馏瓶中的空气进行气相色谱检测挥发石油烃。污泥中石油烃采取和上述方法相同的步骤，不同点是在一开始用无水硫酸钠除去水分^[38]。

（2）微生物数量的测定

称取100mL的采出清液和10g含油污泥，加入到无菌水中，振荡，过滤，变成均一的悬液，对悬液进行稀释，然后涂平板，好氧细菌稀释倍数为10^－6～10^－1、厌氧细菌稀释倍数为10^－4～10^－1，倒置进行好氧和厌氧培养，好氧细菌3d后CFU计数、厌氧细菌10d后CFU计数^{[38，75～86]}。好氧细菌采用蛋白胨固体培养基、厌氧菌采用富集培养基（1.5%的琼脂）^[38，77]。

（3）石油厌氧产气测定

① 气体组分：安捷伦气相色谱仪。

② 检测器：FID200℃；气化进样器150℃。

③ 色谱柱：PONA弹性石英毛细柱（50m×0.2mm×0.5μm）。

④ 柱温：初温35℃，保留15min；以5℃/min速率升温至200℃，保留5min^[34～37]。

取样时先用气体收集器从上方收集气体，然后再用密封注射器取样，进样体积为0.3mL，将标准气体用高纯氮气稀释成不同浓度，在上述条件下进行分析，修正的面积归一法定量气体含量^[78]。

Varian GC-3800气相色谱仪，色谱柱为Al₂O₃（50m×0.53mm×20μm），温度控制条件为初始柱温40℃，2min后到100℃，以10℃/min速率升温至170℃，保持25min。进样口温度为100℃；FID检测器温度为150℃，高纯度氦气为载气^[72]。

（4）石油正构烷烃和柱层析及饱和烃分析

根据石油天然气行业标准SY/T 5119—2016《岩石中可溶有机物及原油族组分分析》及《原油族组分柱层析分析方法》，将降解前后的石油分成饱和烃、芳烃、胶质和沥青质。将降解前后的油样用二硫化碳进行溶解，用GC-FID（CP3800）进行模拟蒸馏分析原油浓度与组分的变化，进样量为0.8μL，毛细管柱为CP5960柱（5m×0.53mm×0.25μm），分流进样（1∶2）。控温程序：起始温度40℃，保留2min；以10℃/min速率升温至350℃，保留10min。载气为氮气^[38]。

GC-MS分析：仪器为Agilent 6890N气相色谱/5975i质谱联用仪。弹性石英毛细柱（60m×0.25mm×0.25μm）。测试条件：进样口温度为300℃；柱温（程序升温），初温50℃进行1min，以20℃/min的速率升温至120℃；然后以4℃/min的速率升温到250℃；再以3℃/min的速率升温到310℃，维持30min。质谱EI源，70eV，照射灯丝电流为100μA，进行全扫描^[34～37]。

（5）石油烃降解率的测定

根据国家标准HJ 637—2012对降解前后的石油烃降解率进行红外分光光度测试，红外分光光度仪先用称重法进行校准，而后对石油烃进行萃取，再根据萃取比换算成油类含量。首先将培养液转移到分液漏斗中，然后酸化到pH≤2，用CCl₄洗涤3次，加入NaCl振荡，静置分层后，取下层萃取液加入含有硫酸钠的玻璃砂芯漏斗中，并用真空泵抽滤，与此同时，对上层溶液再重复刚才的操作。然后将漏斗中的滤液转移到容量瓶中，用CCl₄定容。稀释一定倍数以后，用红外分光测油仪确定石油烃含量^{[38，79，80]}。

（6）降解前后石油烃的黏度

根据GB/T 265—1988标准测量，测定一定体积的液体在重力下，流过一个经标定的玻璃毛细管黏度计的时间。毛细管黏度计是以博斯方程为基础的，然后计算出动力黏度（mPa·s），就是黏度计的毛细管常数与流动时间的乘积。

（7）采出液和含油污泥中各组分及性质分析

全氮测定采用凯氏定氮法，有机质采用重铬酸钾比色法，全磷测定采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法，钾、钠采用火焰分光光度计法，碳酸根和碳酸氢根可采用双指示剂中和法进行滴定，用EDTA滴定法测定钙、镁离子含量，采用原子吸收光谱法测定采出水中等微量元素的含量。

（8）细菌群落的PCR-DGGE分析

在进行细菌群落分析的时候采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）^[71～75]。通过对采出水和含油污泥中的细菌群落进行分析，而且经过PCR对样品中的古菌和细菌的16S rDNA的V3区进行扩增，通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）对微生物群落组成进行分析。下面介绍一下微生物群落的PCR-DGGE分析。

取菌液1mL进行离心操作，转速设定为10000r/min，离心时间为1min，离心后用微量移液枪吸取上清液；重复多次操作，然后将菌体用玻璃珠破碎法进行DNA的提取，通过玻璃珠加入磷酸盐缓冲液（120mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值为8.0）和0.5mol/L Tris HCl（pH值为8.0）、0.1mol/L NaCl、10% SDS；在破壁仪（日本）上进行破壁30s，然后用Tirs饱和酚、异戊醇、氯仿（25∶1∶24，pH值≥7.8）、异戊醇、氯仿（1∶24）进行抽提。以上操作离心条件均为17000g，4℃，5min^[40，81]，所得DNA通过QIAGEN试剂盒进行纯化后进行PCR。通过琼脂糖胶电泳，观察所提DNA的亮度，同时测量OD₂₆₀和OD₂₈₀值，以确定DNA的浓度，然后放－20℃冰箱保存备用^{[40，71～75]}。具体来说，电泳用1倍TAE储备液（加琼脂）进行琼脂糖凝胶电泳，上样缓冲液6×Loading Buffer中含有指示剂溴酚蓝，可显示电泳进程，表2-6为50倍的TAE储备液配方^{[40，71～75]}。

提取DNA后，下面就要进行PCR扩增目的片段。由于后续要进行细菌群落的分析，先是对所有用具进行高温高压灭菌，然后离心机打开预冷至4℃，打开制冰机制冰，用紫外灯对超净工作台灭菌20min，取出DNA在冰上解冻，并且做空白对照，体系为20μL。有关学者提出在进行DGGE分析时，扩增片段要在500bp以下，因此，本章选用了带GC夹的引物341F-GC和534R（由上海生工生物工程有限公司合成）（见表2-7），带GC夹的目的就是防止双链完全解开，更好地使DNA扩增片段在相应的变性剂浓度上停止，达到分离的目的^[71～75]。通过表2-8说明PCR的扩增体系，同时通过多次重复试验，确定了本章试验中的最佳PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

分析细菌后，需要对产甲烷古菌也进行群落分析，首先进行PCR扩增，试验中选择的前引物为pARCH344f-GC，后引物为UNIV 522r，具体序列详见表2-9^{[32～42，71～75]}。通过表2-10说明了古菌PCR的扩增体系，同时通过多次重复试验，确定了本章试验中古菌的最佳PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

变性梯度凝胶电泳分析过程主要是配制聚丙烯酰胺凝胶胶液，本实验选用30%～70%变性剂浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶，如表2-11和表2-12所列。将药品依次加入两个离心管中，一个浓度为30%，一个浓度为70%，加入后用无菌水定溶至16mL，混合均匀，全部溶解后，每管分别加入18μL TEMED溶液和80μL 10% APS溶液；混匀，分别吸入注射器准备灌胶，注射器用灌胶器（BIO-RAD公司）固定好后向胶槽灌胶，灌满后上方插上梳子，凝胶1h，将玻璃板固定，两侧中间要垫塑料片，做好胶槽，将其固定在制胶架上；固定好，下部要垫海绵，以防灌胶时胶液漏出，导致胶液不足。

① 电泳　首先在凝胶期间进行预电泳，因为电泳需要在60℃下进行，因此在将胶放入电泳槽前需要先加热到60℃，待胶凝固，电泳槽中缓冲液升温到60℃后，将胶放入电泳槽；之后用接种枪反复吹胶空；然后上样，间隔上样，上样量为20μL。之后进行电泳，电泳条件为：电压75V，时间14h。

② 染色　待电泳结束后，电泳槽缓冲液温度冷却至室温后，将胶取出，打开胶槽玻璃板，轻轻去除凝胶。要注意：聚丙烯酰胺凝胶易碎，取出后放入去离子水中清洗，清洗后放入EB染色15min。

③ 成像分析　取出染色后凝胶，用去离子水冲洗染色剂，将胶放入成像系统（BIO-RAD公司）成像，保存照片用于分析^[71～75]。

（9）数据统计和分析

作图采用Origin8.0画图软件，数据分析采用SPSS统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL），标准差（SD）和最低显著性检验（LSD）用来比较和分析各组数据之间的差异^[73]。