2.2　实验设计和方法

2.2.1　实验设计

通过对某油田区块的6口油井采出液调研取样，将数个塑料桶装满（约5L），取样之前通入氮气密封，取样后迅速运回实验室，低温保存，同时取深层（30cm以下）被石油污染的土壤，5点取样，混匀后低温－5℃厌氧保存。

其中油田采出液按照好氧条件培养（YHH）和厌氧条件培养（YH），而含油污泥则按照厌氧条件培养（TH），后面的数字代表取样编号。因为有学者研究表明：油藏中的微生物群体是由微好氧菌群和兼性厌氧型以及严格厌氧型细菌组成的，而且油藏中的脂肪烃提供了它们存活的基础^[35～39]，而且有学者从油藏环境中分离得到了好氧微生物^[70～72]，可能是因为随着油藏的开采，大量注入水和其他物质改变了油藏本来的环境^[35，39]。

油田采出液的厌氧富集培养，主要是利用油藏中内源微生物，所用采出液和石油样品都为内源的，所谓内源样品就是对应于各个油井编号和含油污泥编号的样品。

具体来说，在厌氧操作箱中进行初级富集培养，取30mL的油田采出液（除油）和6g油、60mL灭菌无机盐富集培养基充入到120mL无菌瓶中，30℃下富集培养（同时也做了其他温度的相同实验），直到各培养瓶中都能检测到稳定的甲烷产量，培养结束，初筛培养时间为400d，同时以灭菌和不添加油作为对照。选取400d是因为不同来源的菌群产甲烷能力有差异，结束时间是直到各个来源的培养瓶都有稳定的甲烷产生。上述厌氧富集培养过程，需进行培养驯化：常温培养，20d后对培养液下层颜色变深的培养瓶进行转接，取清液，转接4～5次，重复以上过程，得到菌液后富集培养。所用无机盐富集培养基：KH₂PO₄ 5.0g，K₂HPO₄ 5.0g，NH₄Cl 5.0g，NaCl 1.0g，MgCl₂ 2.0g，CaCl₂ 0.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，维生素5mL，微量元素5mL，定容到1L，pH值7.0～7.2，刃天青1.0mg^{[37，70～72]}。

培养基中必须要加入营养物质，因为其可以缩短室内的培养进程以更好地应用于研究。营养激活剂对石油烃厌氧产气的影响将在以后章节进行说明。培养基配制具体步骤为：将培养基加入2L大烧杯中，加热煮沸并不断通入氮气，直到培养基由粉色变为无色，从而指示整个培养基处于无氧状态；停止加热，待培养基冷却后，再加入维生素和微量元素溶液，分装于120mL厌氧培养血清瓶，高温、高压灭菌；最后加入经过生物滤膜除菌后，添加九水硫化钠（终浓度0.03%）和碳酸氢钠（终浓度0.2%）^{[34～37，71，72]}，其中刃天青现用现配，密封保存，按照表2-3和表2-4配制维生素^{[41，71，72]}和微量元素^[71，72]溶液。

表2-3　维生素溶液组成

表2-4　微量元素溶液组成

在厌氧条件下，处理含油污泥时，取10g含油污泥（首先测出含油污泥中的石油烃含量，方法参见2.2.2）加入100mL已高温灭菌的富集培养基中，常温初级培养；然后取上清液转接培养，其余培养过程和采出水的厌氧培养过程相似。以上实验需经过多次转接培养后，测量产甲烷量和石油烃变化。采出液的好氧培养类似于上述过程，不同点在于不用通氮气和煮沸除氧，只需放入控温摇床中培养，120r/min，每隔10d就要转至新鲜培养基继续富集培养。好氧菌富集培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g（固体培养基专用），pH值为7.1～7.2^[73]。其中，图2-1为油田取样及现场调研情况，以求更广泛地收集样品。进一步通过表2-5可以看出6口油井采出液和含油污泥取样地的性质参数。而且含油污泥的含油率为5.8%～11.3%。

表2-5　取样地数据^[74]

注：YH代表厌氧培养油田采出液，后面的编号为取样地油井编号。

图2-1　油田取样