第2章 降解石油烃产甲烷菌群的初筛
油藏环境的有机物质（特别是残余原油）降解过程中，公认的降解终端产物是CH4，而电子受体的耗尽是CH4产生的基础，电子受体主要有硝酸盐、四价锰、三价铁、硫酸盐等。产甲烷古菌会和其他菌群形成互营共生关系，最终使生物质得到一步步的降解并接受末端电子产生CH4[1]。油藏环境中的微生物群体是由微好氧菌群和兼性厌氧型细菌组成的，油藏中的脂肪烃提供了它们存活的基础。在世界范围内，约有10%的石油储量被油藏中的微生物降解破坏，还有另外约10%质量明显下降。在研究油气藏时，有学者做了大量的有关天然气成因的研究工作[2～4]，推测：影响含碳有机质厌氧降解产甲烷的因素有很多，原料中可以供微生物利用的营养物质和降解过程产生毒害物的多少成为该过程的关键因素[5]。微生物驱油进程不需要大规模的能源投入，所以其被看作是一种先进的绿色能源利用战略，而且微生物能利用一些廉价的资源充当激活物使微生物在油藏内部产生可利用的次级产物[6]。这些次级产物的产生可以增加石油的利用率，包括生物表面活性剂、乳化剂、羧酸类、醇类和气体。多种营养物质和功能性外源微生物的注入可以提高微生物石油开采的效率，达到很好的预期效果[6～8]。最近有很多学者已经证实了这一现象，他们通过加入更有潜力的降解石油烃产甲烷微生物来降解石油烷烃，而且取得了很好的效果[9～14]。地质学的证据表明数千年来油藏内部一直进行着微生物降解产甲烷，地球内部的厌氧环境有利于这一过程的进行[13，15～18]。Muller[18]和Jack等[19]在实验室首先研究并证实了在注入外源添加物质的情况下，石油烷烃降解产甲烷，而在一些废弃油藏中残余原油也可以自发地进行这一现象。在油藏液流中也鉴别发现了各种各样的厌氧菌群[19～24]，以及它们的代谢机制的研究都证实了在厌氧环境中石油烷烃降解产甲烷的事实[24，25]。美国的Suflita教授通过微生物的作用将地层中残余原油转化为天然气，并指出了其对经济发展的重要影响[1，26]。
高温高压以及高地层水矿化度的厌氧环境使得微生物的生存环境异常苛刻，人们认为在这种环境下微生物很难生长，1926年，Bastin等在油藏内部分离得到了厌氧菌群[27]，此后，发酵菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、三价铁还原菌和产甲烷古菌等菌群被发现和分离，它们是有着不同功能的厌氧微生物菌群[28]。在20世纪80年代的后期，学者利用实验证明了石油烃的厌氧降解[29]。Lovley等分离得到了高效降解甲苯的菌GS-15株，它们是被分离得到的第一株以三价铁为电子受体的菌株[30]。有学者首次分离到以硫酸盐为电子受体的还原菌Hxd3，它们能够利用长链饱和烃[31]。随后多种厌氧降解电子受体（硝酸盐、硫酸盐、三价铁、二氧化碳、锰离子等）也被大量发现[32～37]。近年来，人们越来越认识到油藏内部的产甲烷过程是多种菌群共同作用的结果，这其中涉及的菌群有发酵菌、硫酸盐/硝酸盐还原菌、厌氧产甲烷菌等[38]，整个过程主要涉及的反应有4种类型：a.在各种还原菌群的共同作用下烃的共生氧化；b.乙酸共生氧化；c.乙酸分解产甲烷；d.二氧化碳还原产甲烷。其中，二氧化碳还原产甲烷为产甲烷的主要方式[39]，有学者研究表明长链烷烃通过复合菌群的共同作用产生乙酸、二氧化碳以及氢气，最终在产甲烷古菌和其他硫酸盐和硝酸盐还原菌的共同作用下产生甲烷和其他气体[40，41]。前人已经研究了硫酸盐还原菌，已知硫酸盐还原菌存在于大部分的油藏中。硫酸盐还原菌是一个复杂的生理菌群，在其众多性质中最重要的是活力、最适温度、氧化能力等，而根据rRNA序列分析又可分为革兰氏阴性嗜温菌、革兰氏阳性芽孢菌、嗜热细菌和嗜热古细菌硫酸盐还原菌四大菌群，它们都以硫酸盐作为电子受体进行无氧呼吸[42]。还有学者研究革兰氏阴性嗜温菌的演化历史，从中得出一些关于细菌演变历史的线索，硫酸盐还原菌的共同祖先是一些光养生物，随后在漫长的演变过程中，一些失去了光合能力变成异氧细菌[43]。通过研究得知Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae已经出现很大分化，Desulfobacteriaceae是原始的细菌，因为它包括一个δ-Proteobacteria，而Desulfovibrionaceae却没有这部分[44，45]。
人们对产甲烷古菌的认识有150多年的历史。人们对产甲烷菌有极大的兴趣在于产甲烷菌对天然气形成的影响，产甲烷菌在自然界与水解菌和产酸菌等协同作用，使有机物甲烷化，产生有经济价值的生物能物质——甲烷。产甲烷古菌和其他复合菌可以通过厌氧发酵过程将有机物降解生成甲烷气体，这期间伴随着其他降解产物的生成，如氢气和二氧化碳，产甲烷古菌广泛存在于土壤、底泥、地热环境、油井、海底沉积物中[46]。同时，厌氧产甲烷古菌处在有机物降解产甲烷的最后环节，通过利用小分子物质产甲烷，甲烷气体有着广泛的作用，而且还是一种温室气体[47，48]。产甲烷古菌有3种营养类型，分别是氢营养型、甲基营养型、乙酸营养型，在可能的途径中通过其他菌群的协同作用将长链有机物降解成短链的无机物或有机物，然后产甲烷菌再降解产生甲烷[49，50]。
① 氢营养型，主要有伊万诺夫甲烷杆菌[51]、热自养甲烷杆菌[52]、布氏甲烷杆菌和嗜热嗜碱甲烷杆菌[53]、热自养甲烷球菌[30]、石油甲烷盘菌属[54]、耐盐甲烷卵圆形菌[55]。
② 甲基营养型，主要有盐水甲烷嗜盐菌[56，57]、斯氏甲烷八叠球菌[58，59]等。
③ 乙酸营养型，主要有马氏八叠球菌[27]。
判断甲烷的具体生活方式和属性情况时[60]。当硫酸盐和硝酸盐这些电子受体缺乏时，有实验表明烷烃仍然可以通过富集培养的菌群厌氧降解，生成二氧化碳和甲烷，另外，Julia Foght认为厌氧芳烃降解以氯酸盐、高氯酸盐或锰离子为电子受体。可以看出芳香烃的生物化学反应过程，基本上涉及了现在烃类降解的主要过程：a.延胡索酸加成反应；b.羟基化；c.甲基化；d.羧基化[61]。
Kniemeyer 等提出了烃降解的一个主要途径，由其碳原子结合到延胡索酸盐的双键碳上，生成烷基或芳香基琥珀酸盐。分析己烷的降解，发现其第二个碳原子结合到延胡索酸盐双键碳原子上，生成（1-甲基戊基）琥珀酸盐（MPS）。而且通过氢同位素标记方法证实了延胡索酸加成反应后有琥珀酸盐生成。而在间二甲苯降解的途径中，延胡索酸和苯环上的甲基发生加成反应，生成苯甲基琥珀酸这一短暂性的中间产物，然后脱氢产生中间产物苯甲酰辅酶A。而由于多环芳烃2-甲基萘的甲基C-H键离解能约为359.2kJ/mol，2-甲基萘的甲基加到延胡索酸的双键碳上产生琥珀酸，经过β氧化产生中间代谢产物2-萘酸，再经过一系列苯环还原反应，最终产生二氧化碳[60，62，63]。
羟基化反应是另一种芳香烃的主要代谢方式，由羟基结合于芳香烃烷基链或苯环上。例如，有学者研究表明在乙苯的亚甲基上发生羟基化反应，生成1-苯基乙醇，还有其他学者认为苯氧化为苯酚就是在脱氢酶的作用下，由羟基进攻苯环羟基化的过程[64～67]。
在研究萘的代谢反应时，首次观察到与一氧化碳脱氢酶不同的作用途径，通过添加碳酸盐激活剂实现了萘的甲基化作用生成2-甲基萘，从而加快了萘的代谢[68]。也有学者提出了可能的羧化代谢途径[69]。
研究油藏中残余油降解产甲烷，首先应该研究油、气、水以及水中的微生物菌群和代谢产物[35～37]。并且油藏中的微生物菌群是由微好氧菌群和兼性厌氧型以及严格厌氧型细菌组成的，可能是因为随着油藏的开采，大量的注入水和其他物质改变了油藏本来的环境[35，39]。在本章中，对来源不同油藏的采出液和不同区块的含油污泥进行考察，其中主要研究是厌氧培养不同来源的采出液和不同区块的含油污泥，考察能否分离出高效的产甲烷菌群，这里所说的高效是本章选取的油井及含油污泥中效果最好的，是在同一实验条件下比较，因为这样互相比较才有意义。
并且本章还对不同来源的油藏采出液进行好氧培养，这种探索研究是本书的一个创新，主要意义在于广泛研究油藏中的不同菌群，而本章的主要创新点在于对多种来源的样品进行初步分析，从而研究厌氧降解石油烃产甲烷菌群，包括深层的含油污泥，最终筛选出复合的高效产甲烷菌群，这将在下一章进行研究，而本章则进行初筛。
① 通过油层物理的分析、地层条件的分析、地层水分析，探讨环境条件如压力、温度、pH值和矿化度对微生物的代谢和生长的重要影响。
② 特定油藏条件下厌氧降解产甲烷混合菌的筛选，建立生物反应器模拟地层环境，以残余油藏为唯一碳源，通过富集培养原油降解微生物，采用动态PCR-DGGE指纹图谱确定微生物混合菌的组成及特征并且构建克隆文库。
③ 通过研究营养激活剂（如碳源、氮源、磷源、微量元素）来提高地层油藏环境中残余油厌氧降解产甲烷的效率，尤其是表面活性剂、络合剂之间的协同作用，从而可能有助于提高微生物的降解产甲烷效率。
④ 利用气相色谱、液相色谱，分析油藏中烃的组分并考察残余原油的利用情况，利用GC-MS以及NMR、IR分析油藏微生物降解产气过程中的代谢中间产物的变化，同时用高级烷烃同位素示踪的方法确定油藏残余油的微生物降解机理。
⑤ 考察残余原油在降解反应前后的性质变化，尤其是运动黏性，密度以及界面张力，提出能解决实际问题的工艺途径。