模块一 微生物检验基础知识
项目一 微生物检验技术绪论
项目引导
微生物检验技术是以微生物为研究对象，通过分析检测微生物种类、数量、性质及产生的安全危害程度，进行产品质量检验和判断的过程。微生物检验结果准确与否直接关系到产品质量是否合格和出厂，必须根据产品性质及质量要求，依据国家微生物学检验标准选择合适的检测方法。微生物检验技术广泛应用于食品、农产品、环境处理、生物制品等领域，以研究微生物的性质、生理功能、代谢产物、微生物腐败、微生物检测和发酵生产为主要内容。
想一想
微生物在日常生活中如何发现？
一、微生物的定义
微生物检验技术属微生物学的分支学科之一，它是通过研究细菌、放线菌、真菌、病毒、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体、原生动物及单细胞藻类等微小生物的形态结构、生理生化特征、代谢方式及产物、遗传变异等生命活动基本规律及差异，并将其应用于食品检验、工业分析、医学卫生、防腐抗菌、环境监测等领域。
我们把自然界里那些肉眼看不见或看不清楚的、必须借助显微镜才能观察到的微小生物，总称为微生物。即微生物是一类个体微小、结构简单、肉眼不可见或看不清楚的必须借助显微镜才能观察的微小生物的统称。每一类微生物都具有各自特有的形态结构，有的是单细胞结构，有的是简单的多细胞，有的甚至无细胞结构，它们广泛存在于自然界中，是地球上最古老的“原住民”之一。
微生物虽然个体微小，但在适宜的环境中生长繁殖迅速。它们在自然界中起着巨大的作用，是引起各类物质循环转化的原因之一，例如土壤中微生物能分解动植物有机质转化为无机质，维持地球上的物质循环。
微生物种类繁多，通常包括非细胞生物的病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒），原核细胞结构的真细菌、古生菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体，以及真核细胞结构的酵母菌、霉菌等真菌、原生动物和单细胞藻类。
一般来说，微生物都是非常简单的低等生物。细菌、放线菌、酵母菌、原生动物、藻类等都是单细胞结构，部分霉菌为简单的多细胞结构，病毒则是由蛋白质外壳和遗传核心构成的非细胞生物，甚至部分亚病毒是只有一种物质成分构成的非细胞生物。微生物形态、大小和细胞类型见表1-1，微生物类型见图1-1。
表1-1 微生物形态、大小和细胞类型
图1-1 微生物类型
二、微生物的特点
个体小、结构简、进化低，是微生物典型的生物学特征。种类多、数量大、代谢旺、繁殖快等特点，是其他生物所没有的，并且这些特点的本质都与微生物个体微小、比表面积大有着密切关系。
（一）个体微小，比表面积大
微生物在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，通常大小以微米和纳米计量。例如一个球菌直径平均1μm，杆菌的平均长度为2μm，而一个病毒粒子仅有约20nm。由于微生物个体微小，因此它们的结构也非常简单，大多数为单细胞结构，少数为简单多细胞结构，病毒、亚病毒属于分子生物。如果将1500个杆菌首尾相连，其长度大约为一粒芝麻的长度，将10～100亿个细菌的重量加起来大约为1mg。然而，微生物的比表面积却大得惊人，如果说人的皮肤面积与体积比为1，那么一个大肠杆菌的比表面积将是人的30万倍，这大大有利于微生物和周围环境进行物质、能量、信息的交换。“个体微小，比表面积大”是微生物诸多特性的前提和物质基础，其他特性都与该特点密切相关。
（二）生长旺盛，繁殖迅速
微生物具有惊人的生长繁殖能力，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。以大肠杆菌为例：大肠杆菌一个细胞重约10-12g，平均20min繁殖一代，1h后繁殖8个，2h繁殖64个，3h繁殖512个，4h繁殖4096个，24h后繁殖72代，约4.7×1021个细菌，重量达到4722t，48h后繁殖约2.2×1043个细菌，重量达到2.2×1025t，相当于4000个地球的重量。由此可见，微生物生长繁殖速度惊人。但因种种条件的限制，这种繁殖速度是不能持久的。尽管如此，微生物这种惊人的繁殖能力在工业发酵生产上应用，短时间内也可获得大量增殖，收获较多产物。
（三）吸收力强，代谢多样
因为微生物个体小，比表面积大，有利于物质交换，因此微生物具有惊人的代谢能力。例如，一头500kg的食用公牛，24h生产0.5kg蛋白质，而同样重量的酵母菌，以糖液和氨水为原料，24h可以生产近50000kg优质蛋白质；再如，产朊假丝酵母合成蛋白质的能力是大豆的100倍，乳酸菌每小时能产生自重1000～10000倍的乳酸。微生物营养物质吸收能力是微生物生长繁殖和产生代谢产物的基础。微生物代谢多样主要包括代谢类型多、代谢途径多和代谢产物种类多。
（四）适应性强，容易变异
微生物适应能力极强，有动植物生存的地方微生物能够生存，人类和动植物不能生存的极端环境微生物同样能够生存。微生物的适应能力是高等动植物难以相比的，它们往往具有极强的耐（嗜）热性、耐（嗜）酸性、耐（嗜）碱性、耐（嗜）盐性、耐（嗜）压性、抗辐射等能力。为了适应复杂多变的周围环境，微生物在长期的进化过程中形成了灵活多样的代谢调控机制以应对各种环境变化。
微生物个体微小，结构简单，通常为单倍体，加上繁殖速度快，代时短，数量多，代谢旺盛，又与外界环境直接接触，即使在极低的自发突变概率（10-8～10-9）下，也可以在短时间内产生大量变异后代，如若再辅以人工诱变（诱变率为10-5～10-6），那么产生变异后代的数目将更加庞大。基因突变是微生物最常见的变异形式，主要涉及形态结构、生长代谢、生理生化、代谢产量等遗传变异。人们利用微生物易变异的特点，进行菌种选育，以获得高产菌株，有利于提高发酵产品产量和质量并降低生产成本。若因保藏方法和条件不当，造成菌种性能退化，同样会对发酵生产造成极其不利的影响。
（五）种类繁多，分布广泛
微生物种类繁多主要指微生物数目和种类多。自然界中的微生种类不计其数，并且不断有新的物种逐渐被发现。据不完全统计，目前已定种的微生物大约10万多种，仅占自然界中存在的微生物总数的1%，也就是说还有近990万种微生物未被发现。一般每克土壤中所含微生物数量高达到几千万至几亿个，其中细菌最多，放线菌次之。
微生物在自然界分布极为广泛，江河湖海、山川平原到处都有微生物的身影。例如，在火山口发现了微生物的踪迹，在南极冰川3500m以下永冻层找到了微生物生命，在远离地表数十公里的高空也有微生物发现，在人、动物的体内、体表均有微生物存在，可以说，微生物是无处不在、无时不在。微生物的种类多样和分布广阔这一特点，为人类对微生物的开发和利用提供了宝贵丰富的资源。
总之，微生物与人类的关系既是朋友又是敌人，它是一把利弊共存的“双刃剑”，由于微生物除具有一般生物所共有的特性外，又具有其他生物所没有的特点。因此，正确利用微生物，实质上就是正确地利用微生物特性为人类更好地服务。
三、微生物检验技术研究内容
微生物检验技术是专门研究微生物与食品、环境、医药等相互关系的一门学科。研究内容涉及与相关微生物的生命活动规律、生理生化特性、形态结构鉴别等内容。针对不同行业和产业，研究微生物的检测方法、微生物利用和控制、食品药品的腐败变质原理并制定相关指标等，为判断产品卫生质量提供科学的参考。
（一）微生物检验与食品工业
微生物腐败变质不仅对食品生产造成巨大的损失和浪费，同时也严重影响人们的身体健康。根据世界卫生组织的估计，全球每年发生食源性疾病的人口超过数十亿，平均每年有1/3的人群感染食源性疾病，即使在欧美发达国家，食源性疾病发生的概率也极高。因此不仅要预防和控制微生物的污染，更要求加强对食品中的微生物进行严格检验，让消费者吃上放心的食品。食品微生物检验意义重大。
微生物作为自然界存在的一种特殊生物群体，与人类食物有着密切的关系。微生物在许多食品生产中起着至关重要的作用，但同时也是导致食品腐败变质的元凶，因此要正确处理微生物与食品间的关系。
1.微生物与食品生产
人类日常食用的很多食品都是由微生物直接作用或参与实现的。如白酒、黄酒、酱油、食醋等是用淀粉质为原料，经微生物制曲、糖化、发酵等阶段酿造而成的；酸乳制品是以鲜乳为原料，经过杀菌作用并接种乳酸菌进行发酵，生产出具有特殊风味的食品；啤酒是以大麦芽为主要原料，大米、酒花等为辅料，经过制麦、糖化、啤酒酵母发酵等工序酿制而成的一种含有二氧化碳和多种营养成分、低酒精度的饮料酒。像这类食品还有很多种，可见微生物在食品生产中发挥了非常大的作用。
2.微生物与食品腐败
食品在加工前、加工过程中以及加工后，都可能受到外源性和内源性微生物的污染。污染食品的微生物主要有细菌、酵母菌和霉菌以及由它们产生的毒素。污染途径较多，加工前可以通过土壤、加工用水、环境空气、操作人员、加工器具、包装运输设备、贮藏环境，以及昆虫、动物等，直接或间接污染食品加工的原料、半成品或成品。加工过程中的清洗、消毒和灭菌过程都又可以使食品中微生物种类和数量显著下降，甚至完全杀菌。但由于食品的成分组成、理化性状、加工方式等原因，都会影响加工后食品中的微生物残留。
微生物引起腐败变质的条件：
①原料本身营养丰富，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和无机盐等含量丰富，易导致微生物污染和腐败。
②适宜的理化条件，如温度、水分活度、pH值、有氧环境等加速微生物生长繁殖。高温、低温抑制微生物的生长和代谢速率，减缓微生物引起的腐败变质；水分活度越低越不利于微生物生长繁殖；细菌、放线菌适于弱碱性环境，酵母菌、霉菌适于酸性环境；好氧微生物（生活中所接触的微生物大多为好氧菌）在无氧条件下（如充氮或抽真空）会被抑制生长。
③其他处理，如盐渍、糖渍、高压、微波、辐照、抗微生物制剂使用等处理也能够杀死或抑制微生物生长繁殖。
（二）微生物检验与医药卫生
微生物种类多、数量大、代谢能力强等特点广泛应用于医药卫生行业。如抗生素、维生素、酶制剂、氨基酸、有机酸等都可以利用微生物发酵生产。利用微生物工程菌发酵生产制药具有成本低、产量高、质量稳定等优点。
大多数微生物对人类和动、植物有益或无害，只有少数可引起人类或动、植物的病害，如伤寒、痢疾、脊髓灰质炎、天花、口蹄疫、禽流感、疯牛病、鼠疫等。具有致病性的微生物称病原微生物，为医学卫生微生物研究的主要对象。医药卫生检验中重要的一部分内容就是微生物检验，即通过研究致病微生物的形态结构、营养代谢、生长繁殖、遗传变异、消毒灭菌、对机体的感染致病和机体的免疫机制寻找出合适的微生物检验法与特异性防治措施，其目的是分析、控制、消灭传染病和与微生物有关的其他疾病，保障人类的健康。
四、微生物检验技术研究任务
微生物检验是衡量食品、农产品、医药等卫生质量的重要指标之一，也是判定被检样品能否食用的科学依据之一。微生物检验技术研究的主要任务是通过微生物检验，可以判断产品加工环境及卫生环境是否符合相应标准要求，能够对食品被微生物污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据。微生物检验要坚持“预防为主”，有效减少或防止食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康。同时，微生物检验对提高产品质量、避免经济损失、保证产品稳定性等方面具有重要意义。另外，微生物检验有利于及时发现并控制微生物污染，完善微生物污染防控机制，避免在生产、保藏、流通中遭受有害微生物的污染，保证产品的安全性。
五、微生物学发展简史
人类对微生物的认识是一段漫长而又曲折的过程。虽然微生物在进化图谱中处于较低等的位置，但因其个体微小，肉眼看不见，很难被发现，人们真正认识了解微生物应是从显微镜发明以后才开始的。纵观微生物学发展历史，根据人们对微生物的由无意识利用到简单形态观察，再到了解微生物特性及培养，最后到全面运用分子生物学理论和现代研究方法揭示微生物生命规律，我们将微生物学发展史分为四个阶段，即史前时期、启蒙时期、形成时期、发展成熟时期。
（一）史前时期
人类对微生物的利用可以追溯到史前文明。早在4000多年前的龙山文化时期，我国就有利用微生物进行酿酒的应用，早在殷商时期中国最早的文字甲骨文中就出现了“酒”字。北魏贾思勰的《齐民要术》中，详细列举了谷物制曲、酿酒、制酱、酿醋和腌菜等利用微生物的记载。此外，国外也有大量有关利用微生物制作产品的史料记载。早在公元前3000年的古埃及就已详细描述了利用微生物制作啤酒和葡萄酒的方法。
总之，这些早期的盐腌、糖渍、烟熏、风干和酿造技术都是人类无意识地利用了微生物学知识的最好实例。
（二）启蒙时期
1664年，英国人罗伯特·虎克（Robert Hooke）曾用原始的显微镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。17世纪中叶荷兰著名显微镜学家列文·虎克（Antonivan Leeuwenhoek，1632—1723）（图1-2）使用自制的显微镜观察并发现了霉菌等多种微生物，实现了人类从宏观世界到微观世界的观察，开创了微生物学启蒙时期。
图1-2 列文·虎克（Antonivan Leeuwenhoek，荷兰，1632—1723）
19世纪上半叶，以欧洲为代表的生物学家对微生物的认识逐步深入。1838年德国动物学家埃伦贝格在著作《纤毛虫是真正的有机体》中，把纤毛虫纲分成22科，其中包括3个细菌科（他将细菌看作动物），这是首次创立“细菌”一词；1854年德国植物学家科恩首次发现杆状细菌芽孢，并将细菌归属于植物界，确定了此后近百年的细菌分类学地位。
（三）形成时期
19世纪下半叶，一大批学者推动了微生物学研究的蓬勃发展，其中贡献最突出的有巴斯德（发酵学之父）、科赫（细菌学之父）、贝耶林克和维诺格拉德斯基等生物学家。
微生物学研究的一套基本技术在19世纪后期已基本建立和成形，包括显微术、灭菌方法、加压灭菌器、纯培养技术、革兰氏染色法、培养皿和琼脂凝固剂等。
法国科学家路易·巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895）（图1-3）将微生物研究从简单的形态结构转移到生理途径方面，奠定了工业微生物学和医学微生物学的基础，开创了微生物生理学。他论证了酒和醋的酿造以及个别物质的腐败都是因微生物发酵引起的，而不是因发酵或腐败产生微生物；证实了生命只能来源于生命，创立了著名的“胚种”学说，并通过著名的曲颈瓶实验强有力地证实了“自然发生”学说的错误；他进一步验证了微生物不同代谢机能也不尽相同，各自需要的生长条件也不同；他提出的防止葡萄酒变质的加热杀菌方法，即巴斯德消毒法，使用该方法可使新生产的葡萄酒得以长期保存；他还研究了人、畜之间的传染病（狂犬病、霍乱等），提出了传染病因是病原微生物的作用，并创立了疫苗接种预防传染病的方法。巴斯德在微生物学各方面的科学研究成果，大大促进了医学、发酵工业和农业的发展。
图1-3 路易·巴斯德（Louis Pasteur，法国，1822—1895）
德国细菌学家罗伯特·科赫（Robert Koch，1843—1910）（图1-4）是病原细菌学研究的开拓者。他首先证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌，肺结核病的病原菌是结核杆菌，并提倡采用消毒和杀菌方法防止类似疾病的传播；他创立了细菌的染色方法，设计出多种培养基，实现了实验室微生物的培养；他建立了细菌纯培养技术，并规定了鉴定病原细菌的方法和步骤，提出了著名的科赫原则。
图1-4 罗伯特·科赫（Robert Koch，德国，1843—1910）
荷兰微生物学家贝耶林克（Martinus Wllem Beijerinck，1851—1931）在研究烟草花叶病时指出烟草花叶病并非由细菌的病原因子诱发，而是由过滤性病毒引起的（即烟草花叶病毒）。
俄国出生的法国微生物学家维诺格拉斯基（Sergei Winogradsky，1856—1953）于1887年发现硫黄细菌，1890年发现硝化细菌，论证了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物学过程以及这些细菌的化能营养特性。他最先发现自生固氮细菌，并运用无机培养基、选择性培养基以及富集培养等原理和方法，研究土壤细菌各个生理类群的生命活动，揭示土壤微生物参与土壤物质转化的各种作用，为土壤微生物学的发展奠定了基础，并且首次提出了自养生物的概念及其与自然循环的关系。
（四）发展成熟时期
微生物学发展成熟期是从19世纪末开始一直至今。其中人们常以1953年沃森（James Watson）和克里克（Francis Crick）提出的DNA双螺旋结构作为节点。在此以前，称之为发展期，而此后为成熟期。
20世纪上半叶微生物学发展欣欣向荣。微生物学研究主要沿着两个方向发展，即应用微生物学和基础微生物学。随着微生物与人类疾病和躯体防御机能的深入研究，促进了医学微生物学和免疫学的发展。1928年弗莱明发现青霉素和1940年瓦克斯曼对土壤中放线菌素的研究成果导致了抗生素科学的出现，这是工业微生物研究的一个重要领域。环境微生物学在土壤微生物学研究的基础上发展起来。随着微生物应用成果不断涌现，进一步促进了基础研究的深入，于是细菌和其他微生物的分类系统在20世纪中叶出现了，通过深入对细胞化学结构和酶及其功能的研究发展了微生物生理学和生物化学。微生物遗传与变异的研究导致了微生物遗传学的诞生。
自1953年美国科学家沃森和英国科学家克里克提出DNA双螺旋结构，微生物学研究重点转向了分子微生物学，并在较短的时间内取得了一系列进展，提出了一些新的概念，如生物多样性、进化、三原界学说，细菌染色体结构和全基因组测序，细菌基因表达的整体调控和对环境变化的适应机制，细菌的发育及其分子机制，细菌细胞之间和细菌同动植物之间的信号传递，分子技术在微生物原位研究中的应用等。经历近150年成长起来的微生物学，在新的时期将作为统一生物学的重要内容继续向前发展。