13　线粒体炫研究

线粒体炫（mitochondrial flash，mitoflash）是近几年新发现的一种反映线粒体电化学兴奋性的功能事件，也是高度保守并且广泛存在的线粒体量子化的信号事件，在真核生物的生理和病理过程中发挥重要作用。线粒体炫信号受到线粒体活性氧、钙、质子等信号的高度调控，与线粒体能量代谢、氧化应激响应等紧密相关。调控线粒体炫活性可能为研究线粒体相关疾病提供新的思路和策略。

线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在很多生命活动中发挥信号枢纽的作用，包括程序性细胞死亡、钙信号调控、活性氧信号转导等。线粒体功能缺陷和信号紊乱与很多重大疾病密切相关，包括代谢紊乱、心肌病、神经退行性疾病、癌症等。线粒体在形态和功能上都是动态变化的。

我们最近发现线粒体存在一种新的功能性动态变化——线粒体炫，随后很多研究团队也开始关注和追随线粒体炫的研究。在这篇文章中，我们总结了线粒体炫的特征、发生机制及调控机制，并重点介绍了线粒体炫在真核生物中作为基本信号事件所发挥的作用。包括线粒体炫在代谢、细胞分化、应激响应、疾病和衰老中的作用。

一、线粒体炫：新发现的线粒体动态活性

线粒体炫是一种时程为10s量级的线粒体动态活性事件，在生理条件下细胞内的单个线粒体能够随机自发地发生线粒体炫。线粒体炫首次被定位于线粒体基质的环状重排的黄色荧光蛋白（cpYFP）所检测到，该探针能感受超氧阴离子和pH的变化。随后线粒体炫被一系列生物和化学探针检测到，包括感受超氧阴离子的mitoSOX、检测活性氧总量的7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate（DCF）、检测氧化还原电势的grxl-roGFP2、检测线粒体基质pH变化的mito-SypHer，pHTomato和SNARF1。另外，检测NADH和FAD的自发荧光发现到线粒体炫发生时伴随NADH和FADH2的瞬时氧化。TMRM或TMRE的同步检测结果表明，线粒体炫发生时伴随线粒体膜电势（ΔΨm）的瞬时部分丢失。总之，线粒体炫是一种新的线粒体动态变化现象，代表着单个细胞器水平的电化学兴奋信号。一个线粒体炫事件包含多方面并且相互关联的信号，即超氧阴离子爆发式生成、还原态向氧化态转化、基质碱化、类似动作电位的膜电势去极化（图1-13-1）。这些组分对于线粒体炫的贡献在不同的细胞类型和培养条件下可能发生改变。

迄今为止，线粒体炫普遍存在于所有检测过的细胞类型、组织和物种中。细胞类型包括：哺乳动物心肌细胞、骨骼肌纤维、神经元、神经胶质细胞、成纤维细胞、软骨细胞、上皮细胞以及多种肿瘤细胞系。线粒体炫具有高度的进化保守性，从植物到动物，从低等生物到高等生物，包括秀丽隐杆线虫、斑马鱼、啮齿类动物及人，均检测到了类似的现象。甚至是单细胞真核生物酿酒酵母，用代谢刺激的方法也能诱发高频率的线粒体炫。而实验体系包括分离的单个线粒体，打孔或完整的细胞，离体跳动的心脏，甚至活体动物如线虫、斑马鱼和小鼠，都能检测到线粒体炫（图1-13-2）。线粒体炫如此普遍、保守，并可发生在分离的单个线粒体内，说明它具有极古老的进化起源。尽管不同物种和细胞类型的线粒体形态、密度、运动性、代谢速度和功能等特征存在很大差异，其线粒体炫的幅度和时程是非常相似的，这也支持关于线粒体炫的古老起源的推测。

二、线粒体炫的发生机制

线粒体炫的发生依赖线粒体呼吸的正常进行。ETC抑制剂，如鱼藤酮（rotenone，复合物Ⅰ）、粘噻唑（myxothiazol，复合物Ⅱ）、抗霉素A（antimycin，复合物Ⅲ）、氰化钠（sodium cyanide，复合物Ⅳ），都能有效抑制线粒体炫的发生。在缺失线粒体DNA和ETC活性的ρ0143B人类骨肉瘤细胞系中，也检测不到线粒体炫信号。在心脏特异性敲除复合体Ⅰ组成亚基Ndufs4的小鼠上，复合体Ⅰ的电子流入受到限制，其线粒体炫活性也被抑制。线粒体炫的发生还依赖于氧气。在严格无氧的条件下，线粒体炫发生被抑制。而且，当呼吸链还原性底物耗竭时，如复合体Ⅰ的电子供体NADH和复合物Ⅱ的电子供体FADH2，线粒体炫也不能发生。此外，用小分子离子载体：如纳摩尔量级的质子载体FCCP、微摩尔量级的H+/K+交换体尼日利亚菌素（nigericin）、微摩尔量级的H+/Na+交换体莫能菌素（monensin），破坏线粒体膜电位和质子梯度，线粒体炫便无法发生。线粒体炫是一种兴奋性的动态现象，这些结果提示线粒体炫发生的前提条件是线粒体处于一个可兴奋的状态。

目前认为，线粒体通透性转换孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的随机瞬时开放可能会触发线粒体炫的发生。mPTP开放最大可通过分子量高达1.5kD的分子。部分线粒体炫发生时伴随着线粒体内染料Rhod2（分子量752Da）或其钙不敏感类似物（分子量980Da）的不可逆丢失，说明线粒体炫发生时线粒体基质内小分子会通过mPTP释放至胞质。部分线粒体炫发生时没有观察到基质内Rhod2或其类似物的释放，因为mPTP在不同条件下开放程度是不同的，可能是由于这部分触发孔道的开放程度较低。

大量研究表明，mPTP开放对于线粒体炫的发生很重要。mPTP的激动剂苍术苷（atractyloside，ATR）能够增加线粒体炫频率，而抑制剂米酵菌酸（bongkrekic acid，BA）则抑制线粒体炫的发生。mPTP的重要调控分子cyclophillin D（CyPD）的抑制剂——环孢霉素A（cyclosporineA，CsA）能有效降低线粒体炫频率。在心脏中过表达CyPD增加线粒体炫频率，而敲除CyPD则使线粒体炫频率减半。然而，在骨骼肌中，不管是敲除CyPD还是用CsA抑制CyPD都不能改变线粒体炫频率。这种组织间的差异可以有以下两个原因：第一，最近发现在没有CyPD的条件下mPTP也能够开放，对CsA也不敏感，说明CyPD对于mPTP瞬态开放不是必需的；第二，骨骼肌中CyPD的表达量仅是心肌中的1/4，提示骨骼肌中的mPTP开放可能很大程度上不依赖于CyPD。因此，CyPD不依赖或者CsA不敏感都不能排除mPTP在线粒体炫发生中的作用。然而，对于mPTP开放如何引发线粒体炫发生，其确切机制还不完全清楚。

最近，Santo-Domingo团队提出一个关于线粒体炫触发机制的模型，认为线粒体融合时形成的内膜融合孔道是触发线粒体炫发生的通道。他们观察到，在小鼠胚胎成纤维细胞中敲除内膜融合蛋白Opa1能完全阻断线粒体炫的发生。我们研究发现Opa1敲除后，本底的线粒体炫活性虽然显著被抑制，但是线粒体炫并没有完全消失。在高渗胁迫下，不管Opa1是否被敲除，线粒体炫发生频率增高到相似的水平，说明内膜融合孔道不是线粒体炫发生的关键分子。同时，Opa1缺失时线粒体呼吸被显著抑制，可能由于ETC复合体和线粒体内嵴形成需要Opa1的参与。因此我们认为Opa1缺失通过抑制线粒体呼吸活性，从而间接抑制自发的线粒体炫活性。

一个线粒体不管它是颗粒状的、线型的还是网状的，它的线粒体炫发生的可能性为nP0，其中，n表示分散的触发位点的个数（如mPTP个数）；P0是孔道瞬态开放的概率。这个模型得到实验证据的支持：在整体细胞水平上，不管是线粒体外膜融合蛋白Mfn1/Mfn2敲除细胞中线粒体片段化，或是Drp1或Mff缺失细胞中线粒体超网络化，每个细胞上的线粒体炫频率是不变的。这样的话，在单个线粒体水平上，线粒体炫事件在每个片段化的线粒体上发生频率小，在超网络化的线粒体上发生频率大。这和震荡触发模型完全不同，震荡触发模型预测不管线粒体分裂还是融合，每个线粒体的振荡频率是稳定不变的。典型的震荡子系统见于心脏起搏——窦房结包含上百个起搏细胞，它们在电学上形成一个功能合胞体，窦房结的动作电位发生速率，与单个分离的起搏细胞相似。

一旦触发，线粒体炫就会自主地发生，完成一系列电化学过程。我们最近提出了一个线粒体炫发生模型（图1-13-3）：假设mPTP开放使水和一些阳离子流入线粒体基质，膜电势去极化，内膜肿胀。这种机械压力可能会导致呼吸电子传递链上蛋白质的异位，电子在传递时更容易在蛋白分子交界处泄漏给氧气（机制1），从而产生爆发式的超氧阴离子。同时，去极化会加速电子传递（从NADH传递到复合体Ⅰ，从FADH2传递到复合体Ⅱ），使氧化还原电势向氧化态偏移（机制2）。超氧阴离子的产生流量可以用一个公式表示：

Jsuperoxide=β[O2][e-]

[e-]代表传递位点的电子占用率，[O2]是局部的氧气浓度，β是电子传递给氧气的效率。机制1中β增大，机制2中[e-]增大。

膜电势去极化和爆发式超氧阴离子生成会刺激呼吸电子传递链运转，加快跨膜泵质子，导致基质碱化。这样，线粒体炫多重的信号在机制上是相关联的。线粒体炫的终止是由于mPTP的随机关闭，一些离子交换体的工作使得基质离子恢复平衡，内膜压力降低使得电子传递路径电子漏减少，膜电势复极化，呼吸电子传递链活性也恢复正常。

我们开发了一个软件——FlashSniper，用来定量地分析线粒体炫的特征，也能自动识别线粒体炫信号。我们发现线粒体炫的幅度符合一个衰减的指数分布，说明线粒体炫作为线粒体的电化学兴奋性活动，是一个具有随机特效的活动。线粒体炫的大小强度变化，可能受触发信号强度的控制（如mPTP开放时程和通透性）。因此，尽管线粒体炫信号是离散的，线粒体炫发生不是全或无模式。

三、线粒体炫：基本信号事件

线粒体炫的发生波及整个线粒体。超氧阴离子爆发式产生可能会对线粒体造成破坏，从膜电势的丢失和电子供体的耗竭来看，线粒体炫是一个耗能过程。那么，究竟为什么线粒体炫在很多真核生物和细胞中都普遍存在而且高度保守呢?它是线粒体在工作时产生的不可避免的有害副产物吗?或者它已经进化成可控的有益信号，在线粒体和细胞信号转导中发挥作用?

多个研究结果表明，线粒体炫与能量代谢之间有紧密的联系。给心肌细胞提供过剩的底物能刺激线粒体呼吸加速，并增加线粒体炫频率。给小鼠注射过量的葡萄糖或者用胰岛素刺激细胞利用葡萄糖，骨骼肌细胞中线粒体炫频率会显著升高。在线虫的培养基中增加葡萄糖浓度会增加线虫咽喉肌细胞中的线粒体炫频率，而移去食物3～6h这种现象就会消失。最新的研究表明，线粒体炫在心脏中通过调节ATP的供需平衡，从而调节ATP稳态。当给心肌细胞提供过剩的底物时，细胞内ATP水平升高，线粒体炫频率也增高，之后ATP水平会恢复原来稳定的水平。人为降低线粒体炫频率能够提高ATP的稳定水平。这些结果说明细胞能量代谢状态能调控线粒体炫频率，线粒体炫能调节ATP稳态。总之，线粒体炫并不是线粒体呼吸的副产物或附带现象，而是发挥一定的信号传导作用。

细胞中的信号分子，通常有生物学的输入信号和响应输入信号的下游效应因子来完成信息的编码、传递和解码三个过程。目前已经找到三个主要的线粒体炫触发信号：基质Ca2+升高，本底ROS和基质纳米范围内的质子。在HeLa细胞上，基质Ca2+水平的持续升高增加线粒体炫频率。过氧化氢、亚硒酸盐、甲萘醌和次氯酸盐等氧化剂，也能增加线粒体炫频率，并呈剂量依赖效应。而且，ROS和Ca2+水平在增加线粒体炫频率方面具有协同效应。虽然mPTP持续开放也受Ca2+、ROS和质子的调节，但是它们触发线粒体炫所需的浓度更低，而且在生理范围内。

线粒体基质的质子也能有效地触发线粒体炫的发生。在心肌细胞和HeLa细胞上用光刺激NBA在基质中释放质子，立即诱发大量的线粒体炫。用低浓度的非生电性氢钾交换体尼日利亚菌素（nigericin）或莫能菌素（monensin）也能触发大量的线粒体炫。基质内自由质子的寿命大约于1.42ns，扩散距离约为2.06nm，所以对线粒体炫具有触发作用的可能是基质内纳米范围内寿命极短的自由质子，而不是基质pH的改变。基质pH在生理范围内变化时，心肌细胞上的线粒体炫频率几乎不变，在一些极端pH条件下，线粒体炫频率甚至降低。对于调节线粒体炫的各个因子来说，在不同实验条件下，可能不同的调控因子占据主导地位。

有了输入信号，线粒体炫是否能编码这些信息呢?首先，线粒体炫中的ROS组分，或称超氧炫，具有作为基本信号分子的条件。ROS是非常重要的信号分子，参与细胞迁移、细胞增殖、自噬、细胞凋亡和衰老等多种信号通路。比如在细胞迁移过程中，Rho作为肌丝蛋白聚合和局部粘连形成的重要介导分子，通过内部一个氧化还原态敏感的基序被ROS直接氧化。另一方面，线粒体炫过程中基质pH的改变，或称pH炫，也可以作为信号发挥作用。例如，在胰腺β细胞中，高营养刺激线粒体基质pH碱化，基质碱化促进ATP合酶合成ATP，并且促进与代谢相偶联的胰岛素分泌。综上所述，线粒体炫的ROS组分和pH组分都能作为信号发挥作用，因此赋予线粒体炫作为信号事件发挥作用的潜在可能。

由于线粒体炫在不同的条件下其幅度和时程变化不大，所以可能是以一种调频的模式发挥信号的功能。线粒体炫频率的调控范围超过两个数量级，这说明线粒体炫有很高的信号背景比、高信噪比和高信息编码能力。如果以调频方式发挥信号功能，线粒体炫是数字信号，相对于模拟信号有以下几个独特的优点。

1.线性关系

数字信号的强度与事件发生频率直线相关，而模拟信号的强度可能需要非线性变换而且会有饱和效应。

2.能协调控制多个因子

如果受调控的下游因子有两个以上，数字信号会使两个下游因子改变同样的幅度，而模拟信号对两个下游因子的调控受其各自的亲和系数影响。

3.高效性

线粒体炫信号在时间和空间上是高度集中的，对于一个一个高阶非线性过程，这样比等量信号在时空上均匀分布更高效。

4.特异性

对于数字信号系统，通过编码蛋白和解码蛋白的特异定位实现信号的区域化作用，大大地提高了信号的特异性。

5.多样性

通过特异性和区域化作用，在不同的环境下会有多种多样的信号被激活。而且，线粒体炫在时间上和空间上的组合变化会扩展其信息编码能力，传递更多样的信号。

6.安全性

以ROS为例，尽管总体的ROS水平持续升高是有害的，短暂的区域化的ROS脉冲却可以在局部激活一些需要高浓度ROS才能激活的效应蛋白或信号通路，从而降低细胞和线粒体损伤的副作用。

细胞内ROS信号具有数字信号和模拟信号的双重性。线粒体内本底ROS是主要的模拟信号，“稳态ROS”设置了本底ROS水平和氧化还原电势，在此基础上，线粒体炫形成一个独特的离散的数字信号系统。本底的ROS能直接刺激线粒体炫发生，而线粒体炫中ROS数字信号对于稳态ROS的贡献是微乎其微的。线粒体炫中的ROS爆发是数字化的、区域性的和随机的，以调频方式进行信息的编码和解码。线粒体炫作为基本的ROS信号单位，可能参与多个层次多个尺度的胞内ROS动力学，包括ROS刺激ROS释放支持的ROS波以及胁迫条件下的全细胞范围内的ROS震荡。通过时间和空间上的协调，线粒体炫作为信号能同时实现高效性、多样性，并且具备取决于细胞形态和环境的专一性。

综上所述，我们推测线粒体不仅是真核细胞的能量工厂，同时也是一个数字化ROS信号或pH信号的发生器。也就是说，线粒体炫提供了一个产生并终止数字化离散ROS信号和其他信号的机制。区域化的ROS信号与线粒体的其他核心功能密切相关，包括生物能学、本底ROS生成、氧化还原态平衡以及线粒体胁迫响应。

四、生物学中的线粒体炫信号

虽然线粒体炫的直接下游效应因子还是未知的，但目前已发现线粒体炫在很多生理或病理过程中发挥作用。线粒体炫的信号传递可能在不同组织和细胞类型中存在很大差异。我们列举了一些例子，能够看到生物学中线粒体炫信号的重要性和多样性（图1-13-4）。

线粒体炫可以作为氧化应激的重要感受器和响应器。例如，在缺氧处理的心肌细胞中，复氧5～10min内线粒体炫频率显著增加。腺苷酸预处理会减轻复氧带来的氧化应激，能有效抑制线粒体炫短期内增加。高渗胁迫通过ROS和Ca2+协同性刺激线粒体炫频率可逆性增加20倍，此过程同时有JNK和p38的激活。在线虫中，氧化剂过氧化氢、百草枯或由KillerRed光化学反应所产生的ROS，都能在咽喉肌肉中使线粒体炫频率增加高达15倍。在HeLa细胞受到氧化应激发生细胞凋亡时，线粒体炫频率增加，并且作为一个早期胁迫响应，在整体ROS水平升高、线粒体片段化、Bax转位和细胞色素C释放之前发生。在这个过程中线粒体炫能够推动细胞死亡的进程，并且对CypD介导的凋亡前调节和Bcl-2介导的抗凋亡调节很敏感。这些结果强有力证明，线粒体炫频率是氧化应激的一个敏感指示器，并且构成氧化应激响应的早期组分。

线粒体炫也参与细胞分化、细胞增殖和细胞干性维持。线粒体炫频率与胚胎小鼠大脑皮质神经前体细胞（neural progenitor cells，NPC）的自我更新负相关。敲除超氧化物歧化酶SOD2或用mPTP激动剂增加线粒体炫频率时，神经NPC殖降低，而用ROS清除剂或mPTP抑制剂降低线粒体炫频率时，NPC增殖增加。在妊娠中期，SOD2敲除小鼠的胚胎大脑皮质中几乎没有增殖的NPC和已经分化的神经元。由于线粒体炫对整体ROS水平影响很小，说明这些药物不是通过调节整体ROS水平来影响NPC增殖的。线粒体炫抑制NPC自我更新，与整体ROS水平促进细胞分化的作用相反。另外，在NPC增殖调控中的线粒体炫信号传递是由ERK1/2激活介导的。线粒体炫还参与体细胞重编程的早期阶段，通过在mRNA水平和蛋白水平增加Nanog的表达发挥作用，其他研究表明，线粒体活性氧在分化和器官发生的信号通路中也承担重要角色，这与以上线粒体炫的相关结果是吻合的。

在电脉冲或谷氨酸盐刺激下，树突棘的长时程增强伴随线粒体炫的发生，认为增加线粒体炫频率能促进树突棘的短时程增强转化为长时程增强，而抑制线粒体炫的发生则会阻断长时程增强的形成。这些结果说明，线粒体炫对于突触可塑性可能发挥重要的信号功能。线虫早期的线粒体炫频率能够预测其寿命。线虫第3天咽喉肌细胞中的线粒体炫频率与个体寿命呈负相关，利用遗传学方法或控制环境因素改变线虫的寿命，线粒体炫频率也随之改变，并与寿命呈负相关。这提示线粒体炫可能反映线粒体的内在时钟，与个体的衰老进程可能有深层次的关联。

有研究表明，在亨廷顿病人和亨廷顿小鼠模型的成纤维细胞中，线粒体双链DNA突变与线粒体炫频率增加相关。线虫皮肤损伤会通过损伤部位钙波扩散触发线粒体炫，这种线粒体ROS爆发会通过肌丝蛋白进行伤口愈合。Ndufs4心脏特异性敲除小鼠的线粒体炫频率降低，并伴随心衰病程的加剧。这些结果说明，线粒体炫为线粒体相关疾病的病理学研究和医疗干预方法研究提供了新的视角。

五、展望

我们已经阐述了线粒体炫作为信号事件的可能性以及支持证据。Ca2+、本底ROS和质子是调节线粒体炫频率的输入信号，线粒体炫如何在线粒体内将这些信息编码并且传递出去呢?可能的编码信号包括ROS爆发式生成、pH瞬态改变、氧化还原态改变和类似于动作电位的膜电势震荡。目前我们还不知道线粒体炫如何影响线粒体内存在的信号通路和功能分子，包括参与三羧酸循环和脂代谢的蛋白质，感受和调节氧化还原态的金属蛋白质，线粒体内转录因子和蛋白质合成机器等，以及这些蛋白的磷酸化、乙酰化和其他翻译后修饰。我们也几乎不了解线粒体炫如何激活线粒体外的下游信号。理论上，线粒体炫可能直接通过扩散的ROS与周围的线粒体和其他细胞器通讯，而单个线粒体pH改变不太可能传播很长的距离，因为在缓冲能力很强的细胞环境下，自由质子的寿命是纳秒量级的，其扩散距离是纳米量级的。也有可能信号分子在线粒体内被激活，然后被运送到其他线粒体中传递信号。在细胞质中，目前仅鉴定出少数与细胞生存和应激响应有关的解码线粒体炫的信号分子。尽管如此，有关线粒体炫的生物学研究还在不断揭示线粒体炫在能量代谢、细胞命运调控、应激响应、疾病和衰老等过程中的重要作用。调控线粒体炫活性可能会为研究线粒体代谢以及相关疾病的信号机制提供新的思路和方法。

（丰高敏　刘蓓蓓　徐婷婷　王显花　程和平）

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