第二章　肝癌门静脉癌栓的形成

第一节　肝癌门静脉癌栓发生机制

肝癌门静脉癌栓形机制的研究是当前肝癌研究的热点。既往国际上缺乏能够直接模拟肝癌门静脉癌栓发生的细胞系及动物模型，本课题组在国际上首次建立了两株来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系CSQT-1和CSQT-2，采用该细胞系成功建立了小鼠的肝癌门静脉癌栓动物模型，并获国家发明专利，为肝癌门静脉癌栓的研究提供了有效工具。本章着重介绍CSQT-2细胞系的生物学特征及其研究应用。

一、CSQT-2细胞系的生物学特征

体外培养PVTT细胞系CSQT-2，在体外观测其各方面细胞特征。首先利用MTT的方法来测量CSQT-2 细胞的生长速度，利用MHCC97-H cells作为阳性对照（图2-1A）。我们发现，CSQT-2细胞与MHCC97-H细胞相比具有更快的增长速度。这一结果说明CSQT-2细胞可能具有更低程度的细胞凋亡速率以及更短的细胞周期。如图2-1B结果所示，大约50%的CSQT-2细胞停留在 S-G2-M阶段，且如图2-1C和图2-1D所示，相比于MHCC97-H细胞，CSQT-2具有更强的生长和迁移能力。以上结果显示，相比于MHCC97-H细胞，CSQT-2细胞具有更高的转移性和生长能力。

根据体外实验的结果，我们探究了CSQT-2 细胞体内的特征。如图2-2A所示，在裸鼠体内CSQT-2细胞具有更强的皮下成瘤的能力。且如图2-2B所示，我们采用Luc2报告基因来标记CSQT-2细胞实时监控裸鼠皮下成瘤信息。图2-2B结果显示，CSQT-2 可以在裸鼠体内形成HCC。之后，为了评估CSQT-2细胞转移的能力，我们向裸鼠心内注射CSQT-2细胞，如图2-2C所示，由于细胞转移，在小鼠的骨和淋巴结位置形成斑块。同样，在脾内注射CSQT-2细胞3周之后，可以观察到CSQT-2细胞转移至肝脏位置 （图2-2D）。由于PVTT是与HCC的发生发展密切相关的，因此我们检测CSQT-2细胞所形成的肿瘤组织与PVTT的相关性。结果如图2-2E所示，我们在裸鼠的肝脏原位移植CSQT-2 肿瘤组织，发现在裸鼠的门静脉系统上产生了PVTT 的病变。所有这些结果显示，CSQT-2 细胞系具有恶性HCC的临床特征。

已有文章报道，HCC可能来源于一部分表达肿瘤干细胞相关标志物如CD133，CD90和EpCAM的癌细胞。因此我们利用流式分析仪来检测不同代数的CSQT-2细胞中CD133，CD90和EpCAM的表达，结果如图2-3所示。我们发现，在前几代中，有一部分的CSQT-2细胞表达CD133，然而30代以后观察不到CD133或者 CD90阳性的细胞。但是EpCAM的表达随着细胞代数的增加明显增加。

癌症的转移是一个由多种转移相关基因的异常表达引发的，涉及细胞增殖、凋亡以及迁移，非常复杂的病理过程。因此我们探究了多种转移相关基因在CSQT-2细胞中的表达，结果如图2-4所示。其中促进肿瘤生长因子EGFR在CSQT-2 细胞中明显过表达。细胞生长调节因子Akt的磷酸化和cIAP1在CSQT-2细胞中的表达明显增加，显示明显抑制了细胞凋亡水平。另外，我们还检测了其他转移相关基因例如uPAR的表达。这些结果显示，大部分的转移相关基因在CSQT-2 细胞中都是高表达的（图2-4）。

二、CSQT-2细胞系的应用研究

CSQT-2细胞系是目前国际上唯一能模拟癌栓发生、发展的细胞系，为癌栓研究提供了有效工具，并被多个研究应用。如应用该细胞系研究发现：HBV引起的炎症可以通过TGF-β/miRNA34a /CCL22/Tregs促进PVTT的发生（Cancer Cell）、术后早期应用索拉非尼可通过阻断肝再生ERK信号通路有效抑制癌栓生长和肝癌转移（Hepatology）、全反式视黄酸可通过降低Epcam阳性肿瘤干细胞的比例，从而降低肿瘤干细胞的干性以及耐药性，提高疗效。该成果为解决索拉非尼或化疗药物耐药开辟了一种潜在有效的临床治疗手段（Hepatology、J Hepatology.），利用细胞黏附因子1（ICAM1）从CSQT-2细胞系中分离出癌栓相关肿瘤干细胞，并发现ICAM1可促进PVTT的形成及肿瘤转移（Gastroenterology）。ICAM1促进PVTT的形成及肿瘤转移是通过长链非编码RNA-ICR的调控实现的（Clin Cancer Res），FOXM1/miR-135a/MTSS1信号调控通路可影响PVTT的发生及肿瘤转移（J Hepatology.），以上的研究提示CSQT-2细胞系在癌栓研究中发挥着重大作用。

三、肝癌门静脉癌栓发生机制的分子生物学研究进展

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率分别居全球恶性肿瘤疾病的第5位和第2位。经过多年的研究和探索，肝癌患者的预后有了一定的改善，但近年来，肝癌患者的总体生存率提高不明显，因为肝癌患者起病隐匿、进展迅速，70%～80%的患者初诊时已处于中晚期，肿瘤侵犯门静脉并形成门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus，PVTT）发生率高。PVTT可以导致肝癌患者肝内癌细胞的扩散、肝功能恶化甚至肝衰竭、门静脉压力升高引起顽固腹水及消化道出血等。若不进行干预，预后较差，中位生存时间仅为2.7～4个月，远低于不伴有PVTT的肝癌患者。PVTT并非中晚期肝癌所独有，很多小肝癌患者也伴有PVTT，导致手术切除后出现早期复发转移的现象。所以说，PVTT被认为是影响肝癌患者预后的重要因素。因此，深入研究PVTT的发生机制，寻找有效的干预治疗措施，将有助于改善此类患者的预后。本章节将介绍近年来关于PVTT的发生机制的部分研究成果。

可供体外研究的细胞系对于肿瘤理论和应用研究具有十分重要的价值。不同组织来源的细胞，其生物特性和适用性不尽相同。虽然一系列肝癌细胞系的建立，为研究肝癌的发病机制、寻找合适的治疗方法等提供了理想的模型，但是鲜有报道来源于PVTT的细胞系，所以建立来源于肝癌门静脉癌栓的细胞系显得尤为重要。Wang等利用人肝癌门静脉癌栓新鲜组织块进行原代培养得到肝癌门静脉癌栓来源的肝癌细胞系-1（Cheng Shu Qun Thrombus Cell Line -1，CSQT-1），并进一步利用肝癌门静脉癌栓原位移植模型，将成瘤后的裸鼠肝脏肿瘤进行细胞原代培养，建立肝癌细胞系，命名为肝癌门静脉癌栓来源的肝癌细胞系-2（CSQT-2）。CSQT-1和CSQT-2具有人肝癌组织的特性，均能稳定生长，具有无限生长的能力，同时因取材于肝癌门静脉癌栓而和其他肝癌细胞系又有诸多不同。CSQT-1及CSQT-2两株肝癌细胞系是体外研究肝癌门静脉癌栓形成及防治的一个良好模型，为进一步研究PVTT的形成机制提供了实验工具。

基因研究获得的信息能为一些疾病提供新的诊断和治疗方法。王葵等研究原发性肝癌伴或不伴门静脉癌栓形成的基因表达差异（表2-1、表2-2）。通过提取标本癌、门静脉癌栓和癌旁组织，对比表达的差异，分析得出FACL4、MAP4K4、HMGA1、POSTN、ZNF282表达明显上调以及PRRX1、CCL19表达明显下调可能在门静脉癌栓的形成发展中有潜在意义，但具体的作用机制尚不清楚，仍需进一步进行研究。Huang等发现KDM6A、CUL9、FDG6、 AKAP3和RNF139基因只存在于癌栓组织，进而推测这些突变基因与PVTT的形成可能存在一定的关联。此外，也有研究表明P53基因的突变、nm23-H1基因杂合性丢失以及MDM2基因的高表达均与PVTT的形成密切相关。这些基因的发现有助于我们进一步了解PVTT的生物学特性，进而进行早期诊断和针对性治疗提供依据。此外，郑亚新等通过肝癌患者组织进行分析提示随着DNA增殖水平的上升，HCC细胞获得了更强的突破包膜生长、侵袭门静脉壁、形成肝内播散等一系列侵袭和转移能力。

微小 RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类短小的（常为17～25nt）单链非编码内源性RNA，能通过降解靶mRNA或抑制蛋白质翻译从而在基因的转录后调控中扮演重要角色。随着对miRNA研究的深入，人们发现，miRNA也在肿瘤的增殖、分化、侵袭转移、治疗反应中扮演了重要角色。Zhou等通过miRNA测序发现了22种可能与肝癌转移相关的miRNAs，其中，miR-28-5p的低表达被证实与肿瘤的转移、复发、预后密切相关。

进一步探究发现，白介素34（interleukin-34，IL-34）是miR-28-5p重要作用靶点，通过调控肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）来发挥作用，并提出了miR-28-5p-IL-34-macrophage的反馈通路。Liu等通过比较肝癌原发灶及门静脉癌栓的miRNA表达谱发现，miR-135a等10个miRNA在PVTT中的表达水平高于原发灶至少1.5倍，miR-433等5个miRNA在PVTT中的表达水平低于原发灶至少1.5倍（表2-3），这表明这些miRNA可能在PVTT的形成中发挥作用。更有研究发现，抑制CSQT-2中miR-135a的表达可以显著抑制其侵袭能力，这也在裸鼠原位种植实验中得到证实。

此外还发现，miR-135a可能是通过上游的转录基因FOXM1和下游的靶向肿瘤抑制基因MTSS1发挥作用的，最终建立了FOXM1-miR-135a-MTSS1通路。Yang等的研究更揭示了一个HBV感染导致PVTT形成的调控通路。他们发现HBV在肝组织内的持续感染以及上调的TGF-β活性可以抑制miR-34a的表达水平，减弱miR-34a对其靶基因CCL22的抑制，上调的CCL22可以招募调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）形成一个免疫抑制微环境，促进肿瘤细胞的免疫逃逸，定植于肝内门静脉系统形成PVTT。HBV-TGF-β-miRNA-34a-CCL22-Treg-PVTT通路是迄今为止最完整的解释PVTT如何形成的通路。

长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）是长度大于200个核苷酸的非编码 RNA。在细胞内lnc RNA可以调节基因转录和mRNA的合成，同时也能影响RNA的稳定性和miRNA在细胞质内的活性。

最新研究表明，lnc RNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。例如lncRNAs ANRIL（antisense non-coding RNA in the INK4 locus）和HOTAIR（HOX transcript antisense RNA）通过促进染色体复合物的生成来促进肿瘤的生长和转移等。Yuan等发现了能被转化因子诱导的lncRNA（TGF-β-induced lncRNA，lncRNA-ATB），lncRNA-ATB 通过调节 TGF-β、miR-200家族和ZEB（zinc finger E-box binding homeobox，E盒结合锌指蛋白）来影响肿瘤早期至晚期的各个过程（图2-5）。

lncRNA-ATB的发现也为临床提供了治疗的新靶点，可以通过抑制lncRNA-ATB的转录来抑制其发挥作用，也可以通过阻断与其密切相关的TGF-β通路达到治疗的效果。另一项研究发现了肿瘤相关的lncRNA-DANCR，其在HCC的表达明显升高，进一步的体内外实验表明DANCR的高表达，明显地增强了HCC的干性，促进了肿瘤的生成以及转移。DANCR与CTNNB1相互结合阻断了miR214，miR-320a和miR-199a，揭示了一个涉及lncRNAs，mRNAs，miRNAs的肿瘤发生的独特机制。此外，Chang等发现的lncRNA GAS5（growth arrest-specific 5）通过调控波形蛋白（vimentin）来影响肝癌细胞的增殖和侵犯。低表达的GAS5与PVTT的发生密切相关，也为临床提供了新的潜在的治疗靶点。

肿瘤的发生是一个多基因、多阶段的复杂过程，是癌基因激活和抑癌基因失活的过程。在组织增生产生原位癌变过程中，除基因水平的变化外，在分子水平还有不同的功能性蛋白的参与。通过对正常个体与病变个体组织蛋白质比较分析，找到某些疾病特异性的蛋白质分子，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。

近年来，随着高通量技术的进步，使得我们可以更全面更系统的去寻找与肝癌相关的蛋白，例如Ding等比较MHCC97H细胞系和MNCC97L细胞系的蛋白质表达差异时，发现转移能力更强的MHCC97H细胞中角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）的表达明显上调，进一步研究发现在肿瘤组织中CK19表达高的患者转移和复发的可能性更高。Liotta提出的肿瘤细胞浸润转移的三步骤假说已经得到广泛认可，PVTT的发生更是涉及肿瘤细胞之间、肿瘤-基质细胞之间的黏附力、趋化、细胞外基质的降解等一系列的过程。

在癌细胞脱离原发灶、移动并附着远处器官等癌浸润转移过程中，细胞黏附分子和细胞黏附力发挥着重要作用。肿瘤细胞间黏附力减弱，有利于肿瘤细胞脱离原发瘤；而肿瘤细胞与基质细胞、内皮细胞黏附能力增强，有助于肿瘤细胞在局部停留、着床并形成转移灶。如上皮型钙黏蛋白（E-cadherin，E-CD）是同种细胞间的主要黏附分子，研究发现黏钙蛋白的 LI-钙黏蛋白（Liver-intestine，LI-cadherin）的表达水平却与肝癌的侵袭性呈正相关，即高表达LI-cadherin的肝癌组织中肿瘤细胞更易脱落，微血管侵犯比例明显增加。血清中细胞间黏附分子Ⅰ型（Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）也被认为与肝癌的转移密切相关，Liu等研究发现与ICAM-1低表达的细胞相比，高表达ICAM-1的细胞具有更强的致瘤能力，进一步研究还发现抑制ICAM-1的表达可以降低肿瘤的发生率和转移率，可见ICAM-1的表达与PVTT的发生也具有密切的联系，但具体作用机制尚不清楚。

趋化因子可以趋化肿瘤细胞，并可调节金属蛋白酶及黏附分子表达增加肿瘤细胞侵袭性，已经证实趋化因子及其受体在决定乳腺癌器官选择性转移中起着非常重要的作用。Li等发现CXCR4的表达在PVTT组织中明显高于在肝癌组织中的表达，临床病理结果发现其表达水平与肝癌的侵犯、有无癌栓及有无肝内或淋巴结转移有关。而在动物体内特异性的阻断、降低CXCR4可以减少癌栓的形成。因此，由趋化因子及其受体介导的肝癌细胞的定向迁移可能可以解释肝癌细胞易于侵犯门静脉的原因。

肿瘤的侵袭与转移的另一个必要条件就是破坏细胞外基质（extracellular matrix，ECM），而降解的基质蛋白对肿瘤细胞的生长增殖有帮助。其中基质金属蛋白（matrixmetalloproteinase，MMP）能降解基底膜和基质，最终肿瘤细胞沿基底膜缺损和基质空隙向周围生长。MMP-9和MMP-2在肝癌伴有PVTT者中含量显著高于无PVTT者。而当MMP-2和MMP-9在肝癌组织的表达高于癌旁肝组织时，癌栓发生率明显升高；相反地，当在肝癌组织的表达低于癌旁肝组织时，癌栓发生率均为0。这说明MMPs可能在PVTT形成中起重要作用。尿激酶型纤溶酶原激活系统（urokinasetypeplasminogenacti-vatorsystem，u-PA）能够水解无活性的纤溶酶原，而转变成有活性的纤溶酶，后者能降解ECM蛋白。在许多肿瘤中都有u-PA及相应调节分子的高表达，并且与肿瘤的预后、复发、转移密切相关。

由于代谢组学具有能将基因和蛋白质水平的微小变化在代谢物水平放大和代谢物的种类远少于基因和蛋白质的数目等众多优点，已经成为系统生物学研究的重要组成部分。研究发现癌症细胞更倾向于利用糖酵解途径产生能量，同时产生更多的乳酸，从而更利于肿瘤的发生发展。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6- phosphate dehydrogenase，G6PD）参与的磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）是控制产生戊糖和NADPH 的关键因素，成为了近年来研究的热点。Hong等研究发现了抑癌基因PTEN，通过Tcl1/hnRNPK来调控肝癌组织中G6PD的表达，进而影响肿瘤的代谢重构和生物合成，并且还发现了高表达的G6PD会影响患者使用索拉非尼的疗效，这对于PVTT的患者的治疗具有重要的指导意义。G6PD的活性也被证明可促进血管生成，提高肿瘤细胞的增殖和侵袭。在体外敲除G6PD可降低血管内皮细胞增殖，迁移和磷酸化的VEGF受体，而G6PD过表达却显示出促血管生成的表型。由此可见，对于代谢相关基因的研究可能成为解释PVTT发生机制的新突破点。

肿瘤细胞与癌周基质之间的动态变化涉及肿瘤发生、侵袭、转移的各个过程，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）和T细胞，能通过促进上皮细胞转化、增加蛋白酶水解活性、调节免疫力的方式来促进肿瘤的侵袭、转移以及新生血管的生成。其中，巨噬细胞几乎存在于所有的组织中，并在维持肿瘤细胞和基质细胞之间的稳态方面发挥着重要的作用。大量的研究表明TAMs能通过损害细胞毒素PD-1+CD8+T细胞免疫应答来推动肝癌的进展。此外，库普弗细胞（Kupffer cells）作为肝独特的巨噬细胞，能产生大量的骨桥蛋白；雄激素受体相关的巨噬细胞，能够通过调控肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）来影响肝脏的损伤修复，还会引起p38的激活进而促进HCC的转移。

研究发现，HCC的转移与癌旁巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）的表达密切相关，即高表达M-CSF的患者预后较差，肝内肝外转移发生率高。因此，针对巨噬细胞的药物例如唑来膦酸，可以消耗肿瘤附近的巨噬细胞，与索拉非尼联用，能明显改善患者的预后。

免疫细胞的不平衡是肿瘤进程中的一个重要的调节器。在肝癌伴转移的患者中发现，Th1辅助T细胞相关的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、干扰素（interferon，IFN）和IL-1的表达明显低于不伴转移的患者，说明增强Th1免疫应答，或许可抑制肿瘤的复发。CD4+CD25+ FoxP3 T细胞已被证实在肝癌肿瘤细胞中高表达，该类T细胞能损害细胞毒性CD8+T的增殖、活化、脱粒以及产生颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔蛋白的能力。与此结论类似的，Gao等研究发现调节T细胞与肝癌细胞的侵袭性、瘤内淋巴管形成有关；细胞毒T细胞可以作为预测肝癌预后的重要指标；针对Treg和效应T细胞的免疫疗法治疗可能成为减少复发、延长PVTT患者生存期的有效手段。

肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）因有很强的转移潜能，也有人将其称为转移型的肿瘤干细胞。其与转移的关系的研究热点集中在：原发瘤中的CSC通过与微环境的相互作用，影响干性因子或通路的变化，从而促进侵袭和转移特性的获得；而在转移灶形成的过程中，CSC自身的代谢变化与微环境的共同作用，又调节了干细胞的自我更新和定居。肝癌中，有研究称CD44+的肝癌干细胞与CD14+的TAM共培养后，TAM产生的IL-6会促进这群肝癌干细胞的扩张和成瘤能力。而当CSC发生播散进入血液循环时，就有可能成为CTC的组成部分。这意味着循环肿瘤细胞中能成功地产生转移灶的组分，可能是CSC或是已具有CSC特性的细胞。例如肝癌中也发现EpCAM+CTC（circulating tumor cell，CTC）具有干细胞特性，部分EpCAM+ CTC有CD133+或者ABCG2+的表达。而这也暗示着CSC可能是CTC的主要功能细胞，或是只有具有或获得CSC特性的细胞才能在转移的过程中存活下来。Guo等更是发现了能影响CSC性能和促进PVTT发生的ICAM-1相关lncRNA（ICAM-1-related，ICR）。因此，肿瘤干细胞的研究可能为我们解释PVTT的形成提供新的方向。

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