第二节 荧光光谱
一、荧光物质
能发出荧光的物质称为荧光发色团。根据发色团种类不同分为两大类：荧光探针（药物荧光剂）和自体荧光发色团。
为了检测生物分子的各种信息，可以在检测物中加入外源性或内源性的荧光剂，这些荧光剂也称为“荧光染料”、“荧光探针”或者“荧光标记”，可以作为示踪剂、荧光免疫测定剂和抗原/抗体感受器从单细胞或单分子对生物大分子的结构、功能及相互作用等信息进行观测，在生物医院领域广泛用于生命现象的观察和研究。
生物荧光检测常用的荧光探针主要有3种类型：
通过荧光极化、相互作用分子间的电子迁移或激发信息来反映分子动力学信息。
这种探针通过荧光极化、相互作用分子间的电子迁移或激发信息来反映分子静力学信息。
这种探针的荧光强度和波长对其环境的黏度和极化率的变化非常敏感，也称为微环境探针。
在生物医学研究与应用领域常用的荧光探针如下：
1.膜荧光探针 主要用于生物膜结构以及脂质运转和代谢动力学研究，常用的探针有BODIPY、NBD（硝基苯二唑磷脂酰胆胺）、DPH（二苯基乙三烯）及其衍生物等。
2.测定细胞活性的探针 如钙黄绿素和荧光黄等探针是那些在健康细胞中才有的酶活性的酶底物。
3.细胞器荧光探针 大量细胞通透性的荧光染料可以选择性标激活细胞的线粒体、溶酶体、内质网和高尔基复合体，可以研究呼吸作用、有丝分裂、凋亡、多药抗性、底物降解和解毒作用、细胞内底转运和分检等研究。常用的探针有绿色荧光蛋白、MitoTracker探针、MitoFluor探针、Mito Tracker探针、LysoTracker探针等。
4.Ca2+、Mg2+、Zn2+和其他金属离子探针 用于研究这些金属离子与生命活动的关系，不同浓度金属离子有不同的探针。常用的Ca2+探针多是Ca2+的螯合剂，包括钙橙、钙绿、水母素等。荧光Mg2+探针有镁绿探针以及Mag-Fura-2，Mag-Fuar-5等。常用的Zn2+探针有FuraZin-1，FluoZin-3等。
5.pH荧光探针 研究细胞内pH对不同生理和病理过程作用，常用的探针有SNAFL探针、SNARF探针、荧光黄和羧基荧光黄及LysoSensor探针等。
所谓“自体荧光”是指不用外加光敏物质，生物组织被一定波长的光激发后，处于激发态的分子在下降到基态的过程中，以光子的形式释放所吸收的能量，即产生了荧光。近年来利用光学现象进行无创物质分析和诊断的技术飞速发展，基于自体荧光的光谱研究在医学研究和诊断方面的应用越来越普遍。
组织内产生自体荧光必须具备3个条件：
1.组织中包含足够浓度的内源性荧光物质，如、色氨酸（tryptophan）、卟啉（porphyrin）弹性蛋白（elastin）、胶原质（collagen）、还原烟碱腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素（flavin，FAD）等；
2.组织能吸收激发的光量子，不同内源性荧光物质的吸收波长范围不相同；
3.组织能辐射出荧光。不同内源性荧光物质发出荧光波长不同，有些波长范围包含不同物质的荧光，其光谱有重叠现象。
荧光发射光谱是不同组织、不同的结构、不同的生化和物化特性等生物组织本质信息的真实反映，相同组织特性荧光光谱相似，不同组织的特性荧光光谱存在差异。
生物组织内有许多能发出荧光的生物分子，主要有氨基酸、结构蛋白、酶和辅酶、维生素和卟啉等。通过测量组织的自体荧光，可以检测和确定组织的生化成分和含量。此外，肿瘤组织及其他病变组织的生长特性和局部环境不用于相应的正常组织。这是因为组织的物理和化学特性都发生了变化，导致内源荧光发色团的浓度或空间分布、发色团的微环境以及局部组织结构等发生改变，造成样本自体荧光光谱在荧光强度、峰位位置、峰值变化速率、不同峰值之间的比值和荧光寿命等方面会存在差异。这些光谱变化反映了病变细胞及组织的特异性，在临床上可以作为癌症早期诊断的依据。
二、荧光光度法
某些物质被一定的光照射时，会在较短时间内发射出波长比入射光长的光，这种光就被称为荧光。1575年，西班牙的植物学家和内科医生N. Monardes观察到在含有一种称为“Lignum Nephritic-um”的木头切片的水溶液中呈现了极为可爱的天蓝色，第一次记录了荧光现象。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“黄石”推演而提出“荧光”这一术语。
1867年，Gop-pelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素混合物的荧光进行铝的测定。到了19世纪末人类已经发现了荧光素、曙红、多环芳等600多种荧光化合物。近年来，随着激光、计算机、光纤技术和电子技术的高速发展，荧光分析法理论不断进步，新型荧光分析法理论不断进步，新型荧光分析仪器也不断问世，建立了一些新的光谱分析手段，推动了荧光分析法在各学科领域的广泛应用。
荧光的产生原理主要基于斯托克斯（Stokes）效应，包括以下三个过程：
1.物质的分子吸收一定的光能，从基态激发到激发态；
2.分子从高能态很快（约10-12秒）到一个不稳定的高能级；
3.当分子从不稳定的高能级返回基态时会伴随光子产生，即有荧光产生。
因为所发射的荧光的波长比激发光长，能量比激发光小，也称为斯托克斯位移。斯托克斯位移越大，激发光对荧光的干扰越小，当它们相差20nm以上时，激发光的干扰很小，可以进行荧光测定。
荧光光谱有以下特点：
1.荧光光谱的形状和激发光波长无关，这是因为荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的而和荧光物质分子被激发至哪一个能级无关；
2.荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似。近似是因为吸收光谱反映的是第一电子激发态的能级分布情况，荧光光谱反映的是基态能级的分布情况。由于基态中能级的分布和第一电子激发态中能级分布是相似的，所以荧光光谱的形状与吸收光谱近似。
荧光分析法和紫外-可见吸收光谱进行物质的定性定量分析相比有以下优点：
1.特异性好 荧光光谱可以检测那些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程。这是因为，紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测时间与其寿命相应的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外线吸收的10-15S的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。
2.灵敏度高 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样荧光不受来自激发光的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱。
荧光光谱包括组织体自体荧光光谱以及利用5-氨基酮戊酸等光敏剂进行体内诱导原卟啉形成的药物荧光光谱（内源性）和药物荧光光谱（外源性）。依据所选用的不同激发光源和检测方式，荧光光谱可以分为稳态和瞬态荧光光谱，前者主要测量荧光的激发光谱、发射光谱、三维荧光光谱等；后者主要表现对荧光寿命的检测。
荧光光谱的特点：
荧光激发光谱简称激发光谱（excitatipn spectrum），是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。
荧光发射光谱称为荧光光谱（emmission spectrum），是在某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况。同一荧光物质其荧光光谱的形状与激发波长无关。不同荧光物质的结构不同，其基态与高能态建的能量差不一样，而基态中各振动能级的分布也不一样，所以产生的荧光光谱进行定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。人体内，一些已知荧光物质及其最强荧光激发与发射波长也已被测量（表1-5-1）。
三维荧光光谱（three-dimensional fluorescence spectrum）。是三维的，即可以获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。这种技术和普通的光分析技术的不同之处在于，一般的荧光激发谱和荧光发射谱是二维的，反映的是荧光物质随激发波长或发射波长的荧光光强变化；而它能够更加全面地反映出组织的荧光光谱信息，可以作为一种很有价值的光谱指纹技术，在环境检测、法庭判证、癌细胞检测和细菌鉴别等方面有广泛应用。因为光谱获得的手段不同，该技术有许多名称，常见的有三维荧光光谱、激发-发射矩阵（excitation emission matria，EEM）、总发光光谱（total luminescence spectra）和等高线光谱（contour spectra）等。
时间分辨（瞬态）荧光光谱可测量荧光寿命。不同的荧光物质在一定波长的激发光和荧光检测波长下具有不同的荧光寿命，根据时间分辨荧光光谱可以区分不同的荧光物质。尽管样本的荧光寿命也随激发波长和荧光检测波长的不同而发生变化，但在相同测试条件下生物生化特性的差异会导致荧光寿命差异。例如，在同一激发光和荧光检测波长下，正常组织和癌变组织的荧光寿命存在显著差异，可以利用这一特性进行癌症的早期诊断。
生物荧光光谱技术可以检测光在不同类型组织中的相互作用，并提供有关分子、细胞和组合的生物化学和形态学信息。已经成为生物医学研究和诊断的一个重要手段。
影响生物荧光的主要因素有：
不同的生物样本含有不同的荧光物质，相同荧光物质的浓度和分布也不相同，其荧光强度和谱形是不同的。
某些生物荧光物质的浓度是和生物的新陈代谢水平相关的，可以反映样本活性。
酸碱度变化会影响有关荧光物质的分布，从而也影响荧光光强。
温度降低，荧光的量子产额和荧光光强增大。
同一离体样本在不同的处理步骤和放置环境下（如灌注、冷冻等），其生化特性不同则荧光光谱会存在差异。
三、荧光光度仪
物质的激发光谱、发射光谱和时间分辨荧光光谱等都是采用荧光分光光度计来测量的。
荧光分光光度计的基本结构可分为光源、单色器或滤光片、样品池、单色器或滤光片和检测器（图1-5-1）。目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯，单色器多用光栅，检测器主要用光电倍增管，普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900nm。
HITACHI F-4500荧光分光光度计采用水平光束测量，它不仅可以测量样品的激发谱、发射谱、三维荧光光谱，还能测量物质的荧光寿命组成的时间分辨光谱。
HITACHI F-4500荧光分光光度计的光学系统图如图1-5-2所示。氙灯发出的光束，通过透镜L1和L2，经过单色器的入口狭缝S1，到达激发光衍射光栅上，然 后从出口狭缝S2出来，照到凹面镜M1；再通过光束分裂器分成两束光，一束光送到监控检测器上，在这儿光通量被测量；另一束光通过凹面镜M2和M3照射到样品池上。来自样品池的荧光和发射光，经过凹面镜M4和平面镜M5，进入发射光单色器的入口狭缝，再经过发射光衍射光栅，从出口狭缝S4出来，再通过凹面镜M6反射到光电倍增管上，在此进行荧光强度的测量。
四、荧光光谱的应用
光谱诊断（spectroscopic diagnosis）或光活检是根据正常组织和癌组织在一定波长的激光激发下发出不同的自体荧光，借助于光谱仪和光学多道分析仪可将这些荧光信号记录为光谱图，分析光谱的形态和强度等参数可以区分不同的组织可达到诊断肿瘤的目的。目前，此技术主要应用于各种消化道和呼吸道肿瘤的诊断，国内外已有较广泛的基础和临床研究。
王伟等研究了正常肺组织和肺癌组织激发诱发自体荧光光谱，结果发现，正常肺组织和肺癌组织的主峰位置不同；肺癌组织的相对荧光强度大于正常肺组织；正常肺组织在560nm及600nm处有2个次峰，而肺癌组织的荧光峰平滑下降；正常组织在580nm与600nm的荧光强度比小于肺癌组织。实验证明，正常肺组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光光谱有明显区别，可用于区分二者。
Jonathan等运用荧光光谱测定法和共聚焦荧光显微法对正常和癌变支气管上的癌变细胞进行检测，他们发现色氨酸是主要的荧光发色团，两种细胞的色氨酸发射强度没有区别，而癌细胞的NADH和黄素荧光强度有明显减少。
Crowell等采用相关系数图的方法对4种结肠组织（正常、增生、腺瘤、癌）的自体荧光光谱进行分类和癌症诊断，取得较好的效果。
医学临床利用光敏剂作为荧光探针可以对肿瘤进行早期光活检。光敏剂与肿瘤细胞之间的特异亲和力，在患者静脉注射或口服光敏剂后的一段时间内进行荧光检查，通过光敏剂的荧光特征峰来实现早期肿瘤的光活检。与自体荧光强度较弱相比，特定光敏剂的荧光不仅信号较强，而且特征明确，有利于增强肿瘤组织与周围正常组织之间的荧光差异。临床上用于光活检的常见光敏剂有氨乙酰丙酸酯类衍生物（如5-aminolaevulinic acid，5-ALA）和血卟啉衍生物（hematoporphyrin derivative，HpD）等。
电压敏感染料是一种膜荧光探针，可以检测细胞膜的跨膜电位。按照染料对膜电位变化的反应速度来划分，电压敏感染料可以分为慢反应电压敏感染料和快反应电压敏感染料，目前快反应电压敏感染料的应用更广泛。
慢染料对电压的响应以秒为单位，其作用机制是：由于带电的荧光染料随膜电位变化在膜内外重新分布，实现电压-光变化。快速染料以毫秒为单位响应膜电压变化，其作用机制是：因为荧光分子的荧光谱在电场下发生改变，实现电压-光变化。电压敏感染料的应用很广，主要用于研究神经细胞、神经网络和大脑功能，在骨骼肌研究中也取得不少进展。
许多研究都表明，尽管组织体的荧光寿命随激发波长和荧光检测的不同而发生变化，但在许多相同测试条件下正常组织和癌变组织的荧光寿命存在显著差异，结果见表1-5-2。特别是利用光敏剂进行检测时，由于光敏的荧光寿命（16ns左右）远大于人体组织的自体荧光寿命（1～6ns），两者的差异更加明显，有利于提高组织活检的特异性。
Li等实验研究了人体结肠正常和癌变组织在397nm脉冲激光激发下，正常组织和癌变组织在635nm荧光发射峰的时间分辨自体荧光光谱，如图1-5-3所示，它们的平均寿命分别为4.32ns±0.05ns，它们之间存在显著的差异，结果将为开展稳态和瞬态时间分辨光谱相结合的方法提供了重要的理论依据。此外，他们还通过自体荧光的激发-发射矩阵来研究肿瘤组织与正常组织的区别，取得了一定的进展。
思考题：皮肤中哪些物质会产生荧光，产生的荧光光谱能说明什么？
生物组织内有许多能发出荧光的生物分子，通过测量组织的自体荧光，可以检测和确定组织的生化成分和含量。生物组织自体荧光的主要物质来源有氨基酸、结构蛋白、酶和辅酶、维生素和卟啉等。自体荧光光谱的最大优点是患者不需要注射光敏剂，但人体组织的自体荧光及其微弱。
荧光发射光谱是不同组织、不同的结构、不同的生化和物化特性等生物组织本质信息的真实反映，相同组织特性荧光光谱相似，不同组织的特性荧光光谱存在差异。