人腺激肽释放酶（human glandular kallikrein，hk2）是由人组织激肽释放酶基因家族编码的一组丝氨酸蛋白酶中的一种。人组织激肽释放酶基因家族位于染色体19q13.3-q13.4。目前已明确人组织激肽释放酶基因至少由15个基因（KLK1～KLK15）组成。此前一直认为只有3个基因：①KLK1，编码胰腺或肾脏激肽释放酶（hk1）；②KLK2，编码人腺激肽释放酶；③KLK3，编码前列腺特异性抗原（PSA，hk3）。雄激素与其受体的羧基端结合并转运至细胞核内，通过受体的氨基端与hk2基因的启动子及增强子区雄激素反应元件结合，激活KLK2基因表达hk2分子。hk2主要由前列腺上皮细胞分泌，但在甲状腺、涎腺及女性乳腺组织中亦有表达。hk2在带有24个氨基酸的激活肽（phk2）作用下，水解hk2前体形成具有237个氨基酸的活性hk2和仅有7个氨基酸的phk2。hk2主要存在于血液、精液及尿液中，正常情况下在血液及尿液中的含量甚少。hk2与PSA一样，在血清中存在的基本形式相同，一种为游离hk2（fhk2），另一种为复合hk2（chk2）。复合hk2主要与一些蛋白酶抑制剂如α ₁-抗糜蛋白酶（ACT）、α ₂巨球蛋白，以及c1灭活剂等结合。但是其在精液中主要与蛋白C抑制剂结合。hk2的功能目前尚未完全明确，体外试验发现，hk2有激活PSA的功能，能将无活性的PSA前体转变成有活性的PSA分子。并可与PSA一同分泌到前列腺腺泡的导管中。体外hk2还能激活酶原或单链尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），而uPA可促进肿瘤的转移，据此认为hk2可能对前列腺癌的转移起作用。

有学者对122例前列腺癌患者血清进行分析，发现血清中hk2的浓度随肿瘤分级分期的增加而升高，其他学者对不同病理分级，不同临床分期的肿瘤进行分析亦得出相同结果，并且发现局灶性前列腺癌患者血清hk2/fPSA、hk2/（fPSA/tPSA）的比值较前列腺增生症血清中hk2/fPSA、hk2/（fPSA/tPSA）的比值高，认为hk2/fPSA、hk2/（fPSA/tPSA）比值的高低有助于肿瘤扩散和转移的判断。有研究者用免疫荧光测定来研究hK2对PCa的特异性，连续采取319份血标本，其中Pca 74例，BPH 193例，带有留置导尿管的BPH（BPHcat）52例。用免疫荧光测量法测定hK2、游离PSA（F）和总PSA（T）血清浓度和它们的比例。结果，Pca组hK2浓度中位数为0.23，BPH和BPHcat组分别为0.05和0.06，差异有高度显著性。在PCa组hK2/PSA比值为12.1%，BPH组为22.4%，差异有高度显著性，但BPH和BPHcat组间差异无显著性。全组的hK2值和各种形式的血清PSA值高度相关，fPSA的 r=0.79，tPSA的 r=0.75，与α ₂抗糜蛋白酶结合的PSA的 r=0.70。在tPSA为4～10ng/ml灰区组中，PCa 18例，BPH 58例，Pca组F/T比值为12.2%，BPH组为21.5%（ P﹤0.000 8），PCa组hK2/fPSA比值为13.9%，而BPH组为7.5%（ P﹤0.000 003）。在敏感性为94.4%时，hK2/F比值特异性为60.3%，而F/T比值仅27.6%；在敏感性100%时，hK2/F特异性为48.2%，故半数患者不需做活检。由此得出结论：hK2/fPSA比值能明显改善PSA灰区（4～10ng/ml）诊断的特异性。有研究者随机抽取了5853名门诊患者进行血清PSA测定，tPSA水平高于3.0ng/ml者行经直肠超声检查与活检等进一步的检查。行活检的611名患者中有604人进行了血清hK2检测，并同时测定其中的tPSA与fPSA含量。行活检的611名患者中有18%直肠超声检查阳性，tPSA 3.0～220ng/ml，有144名前列腺癌患者。在541名tPSA在3.0～10.0ng/ml的患者中活检示BPH者439位，他们的hK2平均值0.057（0.029 ～0.45）ng/ml，活检为PCa者102名，其hK2测定值为0.068（0.029 ～0.40）ng/ml， P=0.008。结合tPSA与fPSA的值，hK2/fPSA（%）在BPH中为7.6（1.4～70.0），Pca中为10.9（2.5～46.0）， P﹤0.000 1。hK2×tPSA/fPSA（ng/ml）在BPH中为0.31（0.077 ～3.1），在Pca中为0.57（0.12 ～1.8）， P﹤0.000 1。因此，他们认为hK2与fPSA、tPSA结合分析可以提高前列腺癌诊断的敏感性，hK2为早期诊断前列腺癌提供了新方法。

PSMA基因定位于11p11-p12，序列全长93 525bp，其中主要功能序列为62 035bp，cDNA长2.65kb，其中1250～1700核苷酸编码区有54%与人的转铁蛋白受体mRNA编码区同源。研究证实，PSMA基因序列由19个外显子和18个内含子组成，PSMA特异性启动子，定位于转录启动位点上游166bp，全长1244bp。PSMA增强子（prostate-specific membrane antigen enhancer，PSME）定位于第3个内含子序列内，大约2000bp。PSMA是一种前列腺细胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白，相对分子质量100 000Da，由3个结构域组成，其氨基端位于细胞膜内，共含750个氨基酸，其中胞内段19个，跨膜段24个，胞外段707个，其胞内段和胞外段有多个抗原表位，与多种蛋白有着密切联系。起初研究者发现，PSMA存在于前列腺癌细胞系（LNCaP）细胞膜中，能被单克隆抗体7E112C5识别，但仅能识别PSMA的胞内段；后来的研究者陆续研制出4种不同的抗PSMA单克隆抗体（J591、J533、J415和E99），它们可以结合PSMA胞外的结构域。免疫组化显示，PSMA在前列腺的正常组织、良性增生组织、上皮内增生（PIN）、癌组织中均有表达，且表达强度依次上升，在PCa中表达强度最高；在PCa淋巴结转移灶、骨转移灶中表达也呈阳性。Western印迹法发现前列腺、PCa组织提取液及精液中含有PSMA，大部分非前列腺组织不含有PSMA，只在脑、唾液腺、小肠中有少量表达；在多种非前列腺的恶性肿瘤也有一定的表达，这些肿瘤主要包括肾透明细胞癌、膀胱移行细胞癌、结肠腺癌、胰导管癌、非小细胞肺癌、软组织肉瘤、乳腺癌等。在非前列腺部位的PSMA具有蛋白酶的活性，在中枢神经系统参与天冬氨酸谷氨酸（NAAG）的代谢；在近端小肠能从多聚γ谷氨酸叶酸盐水解末端的谷氨酸。同其他许多膜表面受体一样，PSMA可通过受体介导的内化作用参与营养物质转运和跨膜信号转导。PSMA是一种前列腺肿瘤细胞的膜蛋白，较少脱落入血，故从患者血清不易检测到。血清PSMA检测通常有两种方法，一种是竞争性ELISA法，另一种是Western印迹分析。第一代的ELISA法使用了两个单克隆抗体，7E112C5和9H102A5，通过比较血清样品和LNCaP细胞与特异性抗体反应的能力，得到相对抑制率，两者的比较可提示血清PSMA有否增高。Western印迹方法较以上的ELISA法更加直观，而且可进行半定量检测。Murphy等对153例前列腺根治术后及31例未发生转移的患者行动态的血清Western印迹分析，表明PSMA的增高与肿瘤的术后复发、发生雄激素抵抗及较差的预后呈正相关，但与肿瘤本身大小无关。为了解辅助内分泌治疗（neoadjuvant hormonal therapy，NHT）后PCa根治术（radical prostatectomy，RP）的患者盆腔淋巴结微转移的重要性，有学者收集了52例经历了NHT的RP患者术中清扫的989枚淋巴结，采用实时定量RT-PCR方法检测PSMAmRNA及PSAmRNA。结果显示：病理检查发现4个患者共11枚淋巴结阳性，而实时RT-PCR发现没有淋巴结侵犯病理证据的19例患者的共40枚淋巴结发生了微转移；11例病理阴性患者的19枚淋巴结被免疫组化染色证实为阳性。该项研究表明：采用实时定量RT-PCR方法检测PSMAmRNA及PSAmRNA对NHT后RP患者淋巴结微转移的诊断起重要作用，并且提示盆腔淋巴结的微转移在那些经历了NHT后行RP患者的肿瘤生化复发中可能起着重要的作用。由于PSMA具有膜结合性及前列腺组织特异性，在前列腺癌特别是激素不敏感前列腺癌中表达升高，因此被认为是免疫导向治疗中最有意义的靶蛋白。

现已开展的临床试验以PSMA作为抗原，以自体树突状细胞（DC）作为抗原递呈细胞，制备出前列腺癌疫苗用于前列腺癌治疗，以产生抗PSMA的特异性免疫反应，PSA水平下降50%，或经放射免疫闪烁扫描证实病变明显减轻作为病情好转的标准。结果如下：①37例复发的患者经此方法治疗后，11例（30%）产生免疫反应，病情明显好转；②33例对激素治疗不敏感的前列腺癌转移患者，8例（24%）在治疗后产生免疫反应，病情明显好转；③对上述19例有免疫反应者进行临床跟踪实验，发现转移组患者平均免疫反应持续期为149天，复发组为187天，大部分（11/19，58%）病例在试验结束时仍有免疫反应（对两组患者的跟踪期分别为291天和557天。由此可以看出，以PSMA为靶向蛋白的免疫导向治疗在前列腺癌的治疗中具有广阔前景。

PCA3即新型前列腺癌抗原3，是非编码信使核糖核酸（mRNA）片段，定位于第9号染色体上（9q21-22）。PCA3全长约25kb，包含4个外显子和3个内含子：1号内含子（20kb）、2号内含子（873bp）和3号内含子（227bp）；4个外显子分别为外显子1、2、3、4。外显子2发生选择性交替拼接，外显子4由4a、4b和4c 3个亚单位选择性多聚腺苷酸化组成。通过RNA印迹（Northern blot）分析可得到3种不同的转录产物（PCA3mRNA），长度分别为0.6kb、2kb和4kb，其中外显子1、3、4a、4b所组成的cDNA（2kb）克隆频率出现最高，占60%，是最主要的转录产物；外显子2也是3种转录产物的一部分，但因其发生选择性交替拼接，故转录产物有限，只有5%存在cDNA克隆；外显子4c则仅存在于最大的转录产物（4kh）中；外显子出现在两个较大的转录产物中（2kb和4kb）。外显子1、3、4a都存在于3种转录产物中。PCA3的3个读取框架交叉的终止密码子的多样性，以及缺乏延伸的开放读取框架，表明PCA3是不编码蛋白质的非编码RNA。最近，发现了PCA3的新基因结构和新的侧面和重叠基因转录产物（如PCA3-TS4同种型）。

PCA3在95%的检测的全部前列腺癌中过度表达，可从癌变前列腺细胞中无害测定，准确度接近100%。在前列腺外组织（良性和恶性）中尚未检测到PCA3转录，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性PC标志物。不像血清PSA、PCA3不受年龄、前列腺体积或其他前列腺病（前列腺炎）的影响。正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌细胞及其转移灶发现，PCA3基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。且PCA3 mRNA的表达水平与前列腺癌Gleason病理分级有关。相比之下，在良性和恶性前列腺疾病的患者之间，PSA mRNA水平差异无显著性。

临床意义PCA3试验可能能解决以下PSA困境：①PSA升高，一个或更多阴性活检结果；②正常PSA，有前列腺癌家族史；③正常PSA，活检阳性；④PSA升高，有前列腺炎；⑤PSA升高，PCa前体病变；⑥积极监测微病灶病。潜在临床应用包括检测根治性前列腺切除术或放射疗法后局部复发和监测服用影响血清PSA的药物（即5α-还原酶抑制剂）的患者。

PCA3满足许多PCa生物标志物的要求，在临床实践中有用：①生物样本取样简便（DRE后尿液）；②方法在检测实验室之间可复现（有可用的商业试剂盒）；③统计学准确度良好（经研究不同来源人口的几个团队证实）。使用PCA3指导选择重复活检的有效方法是在前列腺活检时采集PCA3样本（“反射PCA3”）。如果活检结果阴性，无须患者返回就能执行PCA3检测。

基因芯片技术可以提供每一类肿瘤的基因表达谱信息，将来能够对某一肿瘤患者的基因组进行描述。互联网上储存着大量微阵列和基因组资料，以便研究人员查询。美国国立癌症研究所（NCI）已经建立了肿瘤基因组解剖计划（CGAP），目的是比较和发布主要肿瘤的cDNA全长序列。华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化，将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库中；另外还有342个来自EST克隆，包括一些已确定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因及新近确定的肿瘤相关基因。从正常卵巢组织中获得Cy32标记的cDNA和卵巢癌组织中获得的Cy52标记的cDNA与芯片杂交结果显示，两者之间有30%的cDNA表达水平表现出2倍的差别，9%的cDNA表达水平表现出3倍以上的差别。根据这些差别，研究小组从中挑选出726个cDNA克隆作进一步测序和比较分析，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9（GenBank录入号：M38690）、Epithelial糖蛋白（GenBank录入号：M32306）、P27（GenBank录入号：X67325）等，另外还发现曾经报道过的卵巢癌标志物之一HE4蛋白激酶抑制物基因在基因芯片上也表现出过度表达信号。这些数据不但为以前其他方法获得的研究结果提供了进一步参照，而且有助于研究肿瘤发展过程中参与的分子机制及寻找肿瘤诊断和治疗的靶分子，同时也证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性。由于基因芯片能同时检测多种基因，操作便利，大大提高了工作效率，同时微量测定也降低了成本。与其他分析方法相比较，基因芯片还具有平行、快速的优越性。美国密歇根大学的生物学家对前列腺癌基因表达谱的变化进行了详尽的研究。提取正常前列腺组织（包括癌旁正常组织）、前列腺增生组织、肿瘤组织及3个常用细胞株（DU-145、LNCaP、PC3）的总RNA，反转录成荧光标记的cDNA，与具有9984个点阵的高密度cDNA微阵列（包括5520个已知基因和4464个ESTs）杂交，放射自显影后，对扫描杂交信号的灰度强弱进行分析，建立了不同组织的基因表达谱。选择增生组织做对照是因为前列腺良性生长伴随着上皮细胞增殖率的显著增加，上皮细胞的增殖并不意味着恶性进展，所以比较前列腺癌和前列腺增生的基因表达可以提供前列腺细胞恶性转化的重要信息。通过对表达谱的比较发现，前列腺癌较相应正常组织，许多基因呈现异常表达，其中最有意义的发现是Hepsin基因（编码一种转膜丝氨酸蛋白酶）和Piml基因（编码一种丝氨酸苏氨酸激酶）的上调表达。这两个基因的上调表达经Northern印迹检测得到证实。为了评价Hepsin和Piml的预后意义，研究人员对不同组织中Hepsin蛋白和Piml蛋白的表达水平进行了免疫组化检测，发现大多数前列腺癌组织中Hepsin蛋白和Piml蛋白呈强阳性染色，而且与Gleason分级呈负相关，前列腺癌根治术后的PSA升高与Hepsin和Piml免疫染色的缺失密切相关。研究结果表明，Hepsin和Piml可以作为判断前列腺癌预后的分子标志物。Luo等分析了16个前列腺癌和9个前列腺增生组织的基因表达谱，采用的cDNA微阵列包括6500个人类基因。发现前列腺癌和增生组织的基因表达谱存在明显差异。与增生组织相比，共有210个基因在癌组织中呈现表达差异，其中包括许多以前未曾认识的基因，如Hepsin。Hepsin在前列腺癌组织呈高表达，而在增生组织中呈低表达或缺失表达。前列腺上皮细胞的癌变可能是异常分子不断累积的结果，增生则代表更多正常上皮的过生长而很少发生基因改变。因此认为，由于前列腺区带结构的存在，进一步的研究应对区带特异性基因表达进行分析，这样有助于阐明前列腺细胞良性和恶性生长区带差异的机制。

蛋白质组（proteome）是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的蛋白质表达各不相同，即使同一细胞，在不同的发育阶段、不同的生理条件，甚至不同的环境下，其蛋白质的存在状态也不相同。因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体，远比基因组更为复杂。蛋白质组学（proteomics）是以细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动方式（包括翻译后修饰、转运定位、结构变化、蛋白质间及其他相互作用等）为研究对象，采用高分辨率的蛋白质分离手段，结合高通量的蛋白质鉴定技术，全面研究在特定情况下蛋白质表达谱，从细胞水平和整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识机体的各种生理和病理过程。蛋白质组学研究的内容主要包括表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者是利用各种技术研究机体在生长发育、疾病和死亡的不同阶段，细胞与组织蛋白质组分的变化；后者则通过分离蛋白质复合物，系统研究蛋白质间的相互作用，从而建立细胞内信号转导通路的网络图。

有研究者用蛋白芯片系统检测血清中前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA），再用重组PSMA做标准曲线定量检测，发现PCa患者血清PSMA含量与良性前列腺增生、正常人明显不同。利用树型分析方法处理SELDI-MS蛋白芯片系统，分析PCa患者血清与非PCa的对照组血清所得到的蛋白质谱，用其中的21个蛋白质作为1个诊断组，诊断PCa的敏感性和特异性可达97%，且随诊断组中蛋白数的增加，敏感性和特异性最终可达100%。Adam等用SELDI技术分析了167例PCa、77例良性前列腺增生和82例健康老年男性的血清标本，结合人工智能分析，用血清蛋白质指纹图谱从良性前列腺增生和健康者中区分出PCa，检测的灵敏度为83%，特异性为97%，阳性预测值为96%。目前正在进行纵向分析，追踪5～10年的PCa患者血清标本，有望将PCa的诊断较PSA提前5年以上。有学者采用直径为30μm的激光从不均一的前列腺组织切片中显微切割特异性细胞，通过计算每例标本所捕获细胞PSA的分子量，发现在前列腺正常上皮、上皮肉瘤和浸润性癌中PSA含量依次增高。但该方法所需样本量大、处理时间长，而不适于临床快速诊断。采用激光捕获纤维切割技术（Laser capture microdissection，LCM）将PCa基质、上皮、癌细胞纯化后，分别取500～1000个新鲜的纯化细胞，经Protein Chip TM system分析，发现分子量为4300Da的蛋白质在肿瘤细胞中的表达明显增加，且具有较高的可重复性。由于Protein Chip TM system将多种未知标志物集中于一个芯片上，不需详细查找芯片上的每一种结合蛋白，只要明确相关特异蛋白表达谱就能直接用于联合检测，可大大缩短诊断时间，而且单一的标志物也不会影响诊断的敏感性和特异性。

研究者采用LCM将1500例PCa患者上皮、癌前病变、侵袭组织和正常的上皮细胞分离，发现分子量为20 000～30 000Da的两种蛋白质随前列腺病变的进展，其表达量发生相应的变化，并且从癌前病变的组织中分析出蛋白表达图谱，同时显示了正常蛋白和肿瘤相关蛋白的表达模式。联合应用cDNA微阵列和组织微阵列技术研究PCa和良性病变的基因表达，发现类胰岛素生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）基因和HSP27基因高表达。100%的激素抵抗型肿瘤、30%的原发肿瘤表达IGFBP-2，良性病变无1例表达IGFBP-2；31%的胰岛素抵抗型肿瘤、5%的原发性肿瘤表达HSP27，良性病变无1例表达HSP27。美国国立癌症研究所早期诊断研究协作组织已构建乳腺癌和PCa的高密度组织微阵列，这一技术的应用将发现更多的肿瘤标志物。

多种蛋白质组学技术应用于PCa的研究，一方面发现了新的PCa标志物，为探讨发生机制提供理论基础，另一方面PCa相应数据库的建立也是对蛋白质组学的重要补充。利用蛋白质组学技术鉴定PCa特异的肿瘤标志物，不仅在生物医学的基础研究方面具有重要的价值，也将在PCa的早期诊断和预防中发挥重要的指导作用。

在前列腺肿瘤中已经鉴定出多个基因CpG岛的过度甲基化，导致启动子失活和基因沉默，这些基因编码的蛋白质参与重要的细胞过程或肿瘤抑制活动，DNA的损伤修复、肿瘤细胞侵袭转移和细胞周期控制的途径往往被CpG岛的过度甲基化干扰，这些基因功能的丧失对前列腺癌的起始、发展和转移有重要意义。前列腺癌的形成是一个多步骤过程，有些甲基化发生在肿瘤发生的早期阶段，有些与临床阶段的病理分级相关，而有些对肿瘤侵袭、转移和激素非依赖性有重要作用。近几年发现在前列腺癌中由于DNA过度甲基化造成失活的基因有很多，其中谷胱甘肽S转移酶P1（glutathione S transferase P1，GSTP1）的研究较多，有望成为新的前列腺癌标志物。

SNP是美国麻省理工学院（MIT）提出的新一代多态性标记系统。SNP作为第3代遗传标记，具有比第1代、第2代遗传标记密度高、稳定和易于分型检测的优点。SNP是在人群中只有两个等位基因的基因，又称双等位基因标记，检测时只要通过一个简单的“+/-”分析即可进行基因分型，这使基于SNP的检测、分析方法易于实现自动化。随着有关SNPs研究的不断深入，如果确定了某SNP的基因型或单倍型与PCa的相关性，对PCa的诊断和治疗将可以更有针对性，甚至做到个体化。在流行病学调查中确定PCa的高危人群，以及进行患病危险程度的评价，可有助于建立有效的预警系统，达到有效的一级预防目的。